南方医科大学学报

作者：杜艳丽,韩宗利,王湘雨,万成松

目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐（polyP）的可靠方法。方法提取并纯化大肠杆菌O157:H7 野生株DNA，DAPI与DNA、polyP45结合，测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱；应用共聚焦显微镜，观察细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光，验证DAPI检测polyP的可行性；细菌液氮速冻溶解、-80 ℃速冻溶解、-20 ℃速冻溶解、60 ℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板，观察6种方法对细菌存活的影响；与DAPI作用后，测定荧光值，确定细胞膜通透性的最佳前处理方法；建立标准曲线，测定EHEC野生株、ppk1 两个突变株polyP 含量。结果应用360 nm 激发波长，DAPI-DNA最大发射波长为460 nm；应用415 nm 激发波长，DAPI-polyP 最大发射波长为550 nm；应用405 nm激发光，收集DAPI-DNA蓝色荧光（425~475 nm），应用488 nm激发光，收集DAPI-polyP绿色荧光（500~560 nm）；最佳细菌前处理方法为-80 ℃速冻后室温下自然溶解；标准曲线为Y=1849X+127.5（R2=0.991），测定各株菌polyP量，其中野生株显著高于ppk1缺失突变株。结论DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点，可为进一步研究polyP在肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持。

来源：2019年第03期

《南方医科大学学报》期刊编辑部

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