南方医科大学学报杂志

南方医科大学学报杂志2022年第1期

• 补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的作用机制：基于网络药理学和分子对接方法

  高梦雅, 洪艳丽, 崔媚婷, 黄菁宇, 谈 勇, 聂晓伟

  目的 探究补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的主要活性成分、靶点、通路等药理学作用机制。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选出补肾化痰方中药物的主要活性成分，使用 PubChem和Swiss Target Prediction预测活性成分相关作用靶点；应用GeneCards、OMIM筛选治疗疾病多囊卵巢综合征的作用靶点；将药物靶点与疾病靶点通过Uniprot校正后，取交集靶点；结合STRING构建蛋白-蛋白互作（PPI）网络，并利用Cytoscape3.7.2中的CytoNCA插件对交集靶点进行PPI分析，筛选出核心靶点；采用DAVID数据库进行基因功能GO富集分析和KEGG通路富集分析；利用AutoDock对补肾化痰方中的核心活性成分和核心靶点进行分子对接验证。以动物实验进行验证，24只SPF级雌性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为3 组：对照组［n=8，1 mg/（kg?d）生理盐水灌服35 d］，模型组［n=8，1 mg/（kg?d）来曲唑溶于1%羧甲基纤维素（CMC）中，连续灌服35 d，并予高脂饲料喂养］，治疗组［n=8，造模后予以1 mg/（kg?d）补肾化痰方颗粒剂溶于5%生理盐水中，连续灌服35 d］。小鼠末次给药后，取卵巢组织于-80 ℃保存，Western blot法检测小鼠卵巢组织中核心靶点和核心通路的表达。结果 补肾化痰方中14味中药共筛选出125个潜在活性成分，990个药物靶点，4759个PCOS靶点，药物与PCOS交集靶点434个；核心活性成分主要为β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等，核心靶点主要为PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1等；GO功能富集主要包括药物反应、凋亡过程的负调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等；KEGG富集通路主要包括癌症通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路等；分子对接结果显示核心活性成分β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素与核心靶点PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1均有强烈的结合能力；动物实验结果表明，补肾化痰方能明显改善多囊卵巢综合征相关症状，并下调PI3K，AKT蛋白表达，上调MAPK1蛋白表达，验证了网络药理学的部分预测结果。结论 揭示了补肾化痰方多成分、多靶点、多途径的作用特点，预测并通过实验初步验证了补肾化痰方治疗多囊卵巢综合征的可能作用机制。

• 单味中药治疗心肌梗死的药效物质及作用机制：基于网络药理学和多靶标分子对接方法

  赵 石, 刘珂娣, 段佳林, 陶星茹, 李伟红, 白 杨, 卫培峰, 奚苗苗, 杨红莲

  目的 应用网络药理学及分子对接技术，发现治疗心肌梗死（MI）效果较优的中药，并进一步探讨其药效物质及作用机制。方法 通过TCMSP数据库，根据指定的标准，筛选含有治疗MI的活性成分较多的中药。利用Genecards、OMIM、PharmGkb、PharmMapper数据库获取中药与MI的相关靶标，采用Venny2.1.0软件建立药物靶标与疾病靶标的共同靶标网络。通过R语言对共同靶标进行 GO及 KEGG信号通路富集分析；通过 STRING数据库对共同靶标进行蛋白蛋白相互作用网络构建；通过Cytoscape3.7.2软件中的cytoHubba工具对PPI网络涉及的靶标进行分析并确定关键靶标；通过R语言对关键靶标进行GO及KEGG信号通路富集分析。应用SYBYL-X2.1.1软件对潜在药效物质及关键靶标进行分子对接，以Total Score≥6为参考，筛选药效物质并验证其与关键靶标的对接结合性。复制人脐静脉内皮细胞氧糖剥夺模型，通过蛋白质免疫印迹检测对潜在药效物质与治疗MI的关键靶标进行验证。结果 本研究筛选出丹参、降香含有治疗MI的活性成分较多，涉及PTGS2、KDR等治疗MI的关键靶标16个，主要涉及炎症反应、血管新生、能量代谢与氧化应激等生物过程，HIF-1、VEGF、TNF等信号通路，丹参中的香紫苏醇与PTGS2、降香中的芒柄花黄素与KDR对接Total Score最高。Western blot结果显示，低、中、高计量的紫苏醇与芒柄花黄素分别能够抑制PTGS2与促进KDR的表达，且呈剂量-效应依赖关系，其中中、高剂量组差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 中药丹参、降香治疗MI的疗效较优，其作用机制可能与丹参、降香中的潜在药效物质香紫苏醇及芒柄花黄素调控PTGS2与KDR的表达，调节炎症反应、血管新生、氧化应激与能量代谢，进而发挥心肌保护作用有关。

• 偶联 CD133 核酸适体的载紫杉醇 PLGA-PEG 纳米载体靶向清除CD133阳性肺癌干细胞

  庞丽莹, 黄小龙, 朱玲玲, 肖韩艳, 李梦雨, 关会林, 高 洁, 金 红

  目的 构建偶联CD133核酸适体载紫杉醇的聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇（PLGA-PEG）纳米载体（N-Pac-CD133）拟清除肺癌干细胞。方法 采用乳液/溶剂蒸发的方法制备 N-Pac-CD133，同时对 N-Pac-CD133 进行表征，利用磁珠分离法分离出CD133+ 肺癌干细胞后并对该群体的肺癌干细胞特异性进行检测，同时对肺癌细胞的靶向性和杀伤活性进行检测。小鼠体内接种A549肿瘤后，肿瘤治疗分组：生理盐水，空纳米载体链接CD133核酸适体（N-CD133），紫杉醇，负载紫杉醇的纳米载体（N-Pac）和N-Pac-CD133，8只/组，5 mg/kg紫杉醇，分别于第10、15和20天进行注射。在第40天时，处死小鼠后，对肿瘤进行摘除并称重，同时测量小鼠的体质量。结果 N-Pac-CD133的粒径为100 nm左右，包封率>80%，载药量>8%，在48 h内都显示出持续的药物释放。肺癌细胞的CD133+细胞群体表现出肺癌干细胞的特征：更快的肺癌生长速度（30 d，P=0.001）和更高的肿瘤干细胞基因表达：OV6（P<0.001）、CD133（P=0.001）、OCT3/4（P=0.002）、EpCAM（P=0.04）、NANOG（P=0.005）和 CD44（P=0.02）。与非靶向 N-Pac 和紫杉醇相比，N-Pac-CD133 对肺癌干细胞的靶向性（P<0.001）和细胞毒性作用显著增强。另外，N-Pac-CD133可显著减少肿瘤球的形成（P<0.001）。在治疗终点时，取小鼠肿瘤并对肿瘤进行称量，N-Pac-CD133治疗组和其他治疗组相比，肿瘤体质量显著减小（P<0.001）。结论 CD133核酸适体可以促进紫杉醇纳米载体靶向递送至CD133+肺癌干细胞并杀伤肺癌干细胞。N-Pac-CD133可能是一种有效的靶向肺癌干细胞的治疗手段。

• 棕榈酸通过cGAS-STING-IRF3通路降低心肌细胞的自噬功能

  余蕙麟, 刘 谦, 郭永正, 夏 勇, 罗素新

  目的 探究棕榈酸（PA）对心肌细胞自噬功能的影响及潜在机制。方法 提取大鼠乳鼠心肌细胞（NRCMs）并体外培养24 h，分别加入 10%BSA 以及不同浓度的 PA（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L）共培养 24 h。Western blotting 检测 NRCMs 中自噬指标（PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）以及cGAS、STING、p-IRF3/IRF3的蛋白表达水平。CCK8法检测细胞活性，筛选0.7 mmol/LPA用于后续实验。进一步将cGAS siRNA转染入NRCMs中以敲降cGAS的表达，将NRCMs细胞分为：空白对照组（Control组，无特殊处理）、阴性对照组（NC组，转染NC序列）、cGAS siRNA组（转染cGAS-siRNA敲降cGAS）、PA组（0.7 mmol/L PA处理24 h）、cGAS siRNA+PA组（转染cGAS-siRNA后予以0.7 mmol/L PA处理24 h）。Western blot检测NRCMs自噬相关蛋白指标表达变化，CCK8法检测细胞活性，免疫荧光检测p62和LC3阳性着色情况。结果 经不同浓度PA作用24 h后，NRCMs中PINK1、Parkin，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ+Ⅱ蛋白表达量明显降低（P<0.05），p62蛋白表达量明显增高（P<0.05），且心肌细胞活性明显下降（P<0.05）。将cGAS敲降后，可明显逆转PA诱导的NRCMs自噬功能降低，并改善心肌细胞活性（P<0.05）。结论 PA通过介导cGAS-STING-IRF3通路激活，抑制心肌细胞的自噬功能，导致细胞活性降低。

• 肝细胞癌中促癌miRNA调控网络分析与验证

  叶静静, 徐文琴, 陈天兵

  目的 构建肝细胞癌中生存相关的促癌miRNA与其靶基因的调控网络并对关键miRNA-靶基因进行实验验证。方法 利 用OncomiR和Oncolnc获取肝癌中生存相关的miRNA，并进行表达分析和生存分析；利用miRNet预测miRNA的靶基因，通过GEPIA2、Ualcan分别对靶基因进行生存和表达分析，通过Starbase进行miRNA-靶基因共表达分析，利用Cytoscape软件构建miRNA-靶基因网络，通过Enrichr进行靶基因富集分析，利用String数据库进行蛋白互作网络构建。将NC，hsa-miR-1226-3p的mimic或inhibitor，hsa-miR-221-5p的mimic或inhibitor分别转染HepG2细胞，利用CCK8检测转染后细胞活力的变化情况，另取转染后48 h样品利用Q-PCR检测靶基因表达情况；将NC，hsa-miR-221-5p的mimic或inhibitor分别转染HepG2细胞，48 h后用 Werstern blot检测靶基因蛋白表达情况；将 NC+p-GCDH-WT质粒，NC+p-GCDH-MUT质粒，hsa-miR-221-5p mimic+p-GCDH-WT质粒，hsa-miR-221-5p mimic+p-GCDH-MUT质粒分别转染HepG2细胞，48 h后利用多功能酶标仪检测荧光素酶活性；将NC，hsa-miR-221-5p mimic，pEGFP N1-GCDH质粒，hsa-miR-221-5p mimic+pEGFP N1-GCDH质粒分别转染HepG2细胞，利用CCK8检测转染后细胞活力的变化情况，transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果 从OncomiR和Oncolnc数据库中分别得到223个（P<0.05）和146个（P<0.05）在肝癌中与生存相关的miRNA，两者交集为131个；结合表达分析和生存分析的结果共鉴定出 48 个促癌 miRNA；miRnet 共预测出 10 278 个靶基因，通过生存和表达分析符合预期的为 44 个，miRNA-mRNA共表达分析后的结果显示 27 个靶基因符合预期。通过 Cytoscape软件构建的 miRNA-靶基因网络包含了 25个促癌miRNA和27个抑癌基因。富集分析结果显示靶基因集中作用于脂肪酸代谢通路。验证实验显示，转染hsa-miR-1226-3p的mimic和inhibitor，hsa-miR-221-5p的mimic和inhibitor后，其对应的靶基因mRNA或蛋白水平均显著改变（P<0.05）；hsa-miR-221-5p mimic 和 p-GCDH-WT 质粒共转可显著降低其荧光素酶的活性（P<0.05）；pEGFP N1-GCDH 质粒和 hsa-miR-221-5pmimic共转可显著恢复其对细胞活力，以及细胞迁移、侵袭能力的影响（P<0.05）。结论 通过综合分析鉴定了肝癌中的促癌miRNA并构建了其调控网络；脂肪酸代谢可能是肝细胞癌中促癌miRNA发挥作用的重要的靶标信号通路之一。hsa-miR-221- 5p/GCDH轴是肝癌进展的重要分子机制。

• TRIM21可抑制肝癌细胞的侵袭能力：基于泛素化途径降解β-catenin

  张志红, 朱真如, 盛海龙, 孙景苑, 曹传辉

  目的 探讨TRIM21基因在肝癌侵袭表型中的作用及机制。方法 利用siRNA敲低肝癌细胞MHCC 97H，HCC LM3中的TRIM21、β-catenin基因，将肝癌细胞分为对照组：转染对照siRNA；TRIM21敲低组：转染siTRIM21 RNA；CTNNB1敲低组：转染siCTNNB1 RNA；双敲低组：共转染siTRIM21 RNA及siCTNNB1 RNA。利用Western blotting验证敲除效率及相关通路的激活或抑制情况。通过Transwell侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭性。通过尾静脉注射敲低TRIM21的HCC LM3细胞构建裸鼠肺转移模型以观测其肺转移能力。在HEK 293细胞中过表达TRIM21，将HEK 293细胞分为对照组：加入转染试剂；过表达组：转染flag-TRIM21。并利用Co-IP检测TRIM21蛋白与β-catenin的相互作用及泛素化水平。生信分析TCGA数据库中CTNNB1highTRIM21high和CTNNB1highTRIM21low两种亚型肝癌的预后。结果 敲低TRIM21可以显著增强肝癌细胞MHCC 97H和HCC LM3的侵袭能力（P<0.01，P<0.05）和HCC LM3细胞的肺转移能力（P<0.01）。机制研究发现，TRIM21可通过泛素化蛋白酶体途径降解β-catenin以减少其入核，进而降低肝癌细胞的的侵袭性（P<0.0001，P<0.05）。由于TRIM21表达水平降低使肝癌细胞中Wnt信号通路激活，最终使 CTNNB1highTRIM21high亚型肝癌患者的生存预后明显优于 CTNNB1highTRIM21low亚型肝癌患者（P<0.05）。结论 TRIM21能通过泛素化途径降解β-catenin来抑制肝癌细胞的侵袭性，这可能导致了CTNNB1highTRIM21low肝癌患者预后较差。

• 27-P-CAUA通过抑制HER2/PI3K/AKT信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡和线粒体自噬

  黄 超, 王宏婷, 王存琴

  目的 探讨大叶冬青叶中三萜类活性成分27-P-香豆酰基-乌索酸（27-P-CAUA）对乳腺癌细胞增殖抑制的作用机制。方法 27-P-CAUA处理HCC-1806细胞24、48、72 h后，CCK-8法检测HCC-1806细胞存活率；集落克隆法检测27-P-CAUA对细胞的增殖抑制作用；JC-1检测线粒体膜电位改变；流式细胞术检测细胞凋亡情况；细胞免疫荧光观察C-Caspase-3、P62表达；氯喹预处理后，Western blot观察27-P-CAUA对LC3I/II、P62以及HER2信号通路蛋白的影响。结果 CCK-8和集落克隆结果显示，随着药物浓度增加和时间延长，27-P-CAUA对HCC-1806乳腺癌细胞的抑制作用逐渐增强（P<0.01），24、48、72 h的IC50值分别为83.671、49.479、19.578 μmol/L；JC-1检测结果显示，线粒体膜电位改变明显（P<0.01）；流式细胞术结果显示，27-P-CAUA可诱导细胞发生凋亡，细胞早期调亡比率增加 3.34%；免疫荧光结果显示，C-Caspase-3表达增强，促进细胞凋亡，40 μmol /L 27-P-CAUA能显著诱导细胞凋亡（P<0.01）。Western blot和细胞免疫荧光结果显示，27-P-CAUA降低LC3II表达，导致P62降解，诱导自噬发生。经氯喹预处理后，27-P-CAUA诱导自噬可被逆转。此外，27-P-CAUA可抑制细胞内Her2及AKT蛋白的磷酸化，细胞内的Her2以及磷酸化AKT蛋白表达逐渐减少（P<0.01）。结论 27-P-CAUA可通过抑制HER2/PI3K/AKT信号通路，抑制HCC-1806细胞增殖，诱导细胞发生线粒体自噬和凋亡。

• 隐孔菌倍半萜类成分抗肿瘤的作用机制：基于分子对接方法

  周凌云, 赵梓童, 熊 枫, 陈云艳, 孙 玉

  目的 应用分子对接技术及分子动力学模拟，探讨隐孔菌中倍半萜类成分抗肿瘤作用对应靶基因及可能的作用机制。方 法 基于该类成分化学结构，利用在线反向找靶网站Pharm Mapper、SEA、Target Hunter及相关文献研究对可能的抗肿瘤靶标进行初步预测。运用Discovery Studio 4.0（Libdock功能）和Maestro12.3将隐孔菌中倍半萜分子与潜在可能靶标进行分子对接，根据打分情况，推测可能结合靶标；通过2D相互作用图对倍半萜分子与靶标相互作用情况进行分析；结合实验测得活性数据，推测不同倍半萜骨架对于活性的影响因素；选取体外细胞毒活性最好的化合物4结合的最佳构象与靶标形成复合物，与纯靶标蛋白序列一起进行分子动力学模拟，分析均方根偏差（RMSD）值和均方根浮动（RMSF）值，探讨化合物与靶标结合的稳定性。结果 隐孔菌类倍半萜类化合物与Akt（蛋白激酶B）前端蛋白序列（1UNQ）结合最优。2D相互作用图显示氢键和静电力是两者产生相互作用的最主要方式。通过分析不同倍半萜骨架分子的结合最优3D构象，认为分子骨架的微小改变产生了位阻效应，引起各分子活性差异。通过对化合物4的最佳构象与1UNQ形成复合物进行10 ns 的动力学模拟，其RMSD 值小于靶标纯蛋白序列的RMSD值，表明化合物4与1UNQ结合稳定。结合文献报道的1UNQ活性位点，推测隐孔菌中倍半萜类分子抗肿瘤的作用机制是该类分子能够引起Lys-14位乙酰化，导致Akt无法与下游PIP3结合，从而影响肿瘤细胞的增殖。结论 隐孔菌中倍半萜类化合物潜在作用靶点为蛋白激酶B前端蛋白序列1UNQ，通过对靶标Lys-14位乙酰化的方式影响肿瘤细胞的增殖，该研究为隐孔菌中倍半萜类成分作用机制的研究和进一步开发利用提供了科学依据。

• RFWD2调控小鼠大脑皮层神经元树突发育及树突棘形成的功能效应

  孙婷婷, 王圆圆, 方祝玲, 徐佳佳, 马世玟, 常久翔, 刘高峰, 郭 俣, 刘长青

  目的 探讨环指和色氨酸-天冬氨酸重复序列结构域2（RFWD2）差异表达对小鼠大脑皮层神经元树突发育及树突棘形成的功能效应。方法 利用免疫荧光鉴定RFWD2在小鼠全脑的定位及表达谱，通过RFWD2与神经元突触蛋白的共定位，明确其在神经元的细胞定位。通过电转染RFWD2-Myc过表达与shRNA载体，分析其对体外培养小鼠大脑皮层神经元树突发育、树突棘形成与突触功能的影响及作用机制。结果 RFWD2在小鼠大脑皮层与海马区均高表达，与突触形成具有明显的正相关性。RFWD2在神经元的突触前膜及后膜均有表达，与神经元树突的长度、分支数量与复杂性呈正相关。与对照组相比，RFWD2 过表达显著降低了神经元突触蛋白数量［突触小泡蛋白（SYN）4.5±1.2 vs 17.2±2.4/10 μm，P<0.01；突触后致密蛋白（PSD95）：2.1±0.3 vs 8.5±1.3/10 μm，P<0.01］；而RFWD2抑制表达显著增加了突触蛋白数量（SYN：19.6±2.6/10 μm，P<0.05；PSD95：11.5±1.1/10 μm，P<0.05）。与对照组和RFWD2过表达相比，RFWD2抑制表达降低了树突棘的数量（4.3±0.2 vs 6.2±0.5/10 μm，P< 0.05；4.3±0.2 vs 6.9±1.1/10 μm，P<0.01）。结论 RFWD2可通过Pea3家族成员与c-Jun的泛素化影响突触蛋白的表达，调控小鼠大脑皮层神经元树突发育、树突棘形成与突触功能效应，为后期作为靶点开展神经系统疾病的治疗奠定基础。

• CCN5在子宫内膜异位症患者组织的表达及其作用机制

  蔡 虹, 刘 勉, 林妙玲, 李 红, 沈 朗, 全 松

  目的 分析CCN5在卵巢子宫内膜异位囊肿组织中的表达情况，探究其对子宫内膜基质细胞（HESCs）增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 收集并比较卵巢子宫内膜异位症患者组织与正常对照组在位子宫内膜组织中CCN5的表达水平；利用重组腺病毒Ad-CCN5构建过表达CCN5的人子宫内膜基质细胞；采用si-RNA构建敲低CCN5的人子宫内膜基质细胞。利用CCK-8实验检测不同表达水平CCN5对HESCs细胞增殖能力的影响；划痕实验、Transwell小室侵袭实验检测不同表达水平CCN5对HESCs细胞迁移与侵袭能力的影响；Western blot检测不同处理组 HESCs中上皮-间充质转化（EMT）标记物 E-cadherin、N-cadherin，snail-1和vimentin的表达水平。结果 卵巢子宫内膜异位组织中CCN5的表达水平较正常对照组在位子宫内膜显著降低（P<0.01）；过表达CCN5可以抑制HESCs的增殖、迁徙及侵袭能力；EMT标记物E-cadherin表达升高，N-cadherin、Snail-1 和Vimentin表达降低，EMT受到显著抑制（P<0.01）。而敲低CCN5的表达可以显著增强HESCs的增殖、迁移及侵袭（P<0.01），降低E-cadherin表达，升高N-cadherin、Snail-1和Vimentin表达，促进HESCs发生EMT转化。结论 CCN5在卵巢子宫内膜异位组织中的表达水平显著降低，可能通过调控HESCs的增殖、迁移与侵袭能力及影响EMT，在卵巢子宫内膜异位症的发生发展中发挥重要作用。

• 虎杖苷减轻大鼠创伤性颅脑损伤后的肠损伤：基于激活Sirt1介导的SOD2和HMGB1去乙酰化抑制氧化应激和炎症反应

  秦 娜, 黄 林, 董 瑞, 李 芬, 唐叙恒, 曾振华, 王兴民, 杨 翃

  目的 探讨虎杖苷（PD）对创伤性颅脑损伤（TBI）后大鼠肠粘膜损伤的保护作用及其机制。方法 采用液压冲击损伤（FPI）方法用SD大鼠复制TBI动物模型，分别在TBI后12、24、48、72 h收集标本，每组5只；另将大鼠随机分为Sham组（n=5，除了FPI操作其他均进行）、TBI+NS组（n=5，TBI后给予和PD组等容积的生理盐水）和TBI+PD组（n=5，TBI后给予30 mg/kg的PD）。记录大鼠体质量和粪便含水量，观察空肠组织病理，检测D-乳酸（D-LAC）、二胺氧化酶（DAO）、ZO-1和claudin-5水平，测定活性氧自由基（ROS）、过氧化脂质（LPO）和超氧化物岐化酶2（SOD2）含量，检测空肠促炎因子表达水平，检测Sirt1活性，SOD2和HMGB1乙酰化水平。结果 TBI大鼠体质量下降，粪便含水量减少，血清D-LAC、DAO水平进行性升高（P<0.05）。空肠组织损伤加重，ZO-1、claudin-5、SOD2、Sirt1活性明显下降（P<0.05），LPO、ROS、促炎细胞因子、SOD2和HMGB1乙酰化水平增高（P< 0.05）；与TBI+NS组相比，TBI+PD组大鼠体质量恢复，粪便含水量增加，D-LAC和DAO水平降低（P<0.05），空肠组织病理损伤减轻，ZO-1、claudin-5、SOD2表达水平、Sirt1活性增加，ROS、LPO、促炎细胞因子、SOD2和HMGB1乙酰化水平降低（P<0.05）。结论 PD通过激活Sirt1介导的SOD2和HMGB1去乙酰化减轻氧化应激及炎症反应，改善TBI大鼠肠粘膜损伤。

• 树突棘及突触发育障碍诱发自闭症小鼠核心症状的机制

  王菲菲, 王路义, 熊 玥, 邓 静, 吕明其, 汤博诣, 张潇月, 李英博

  目的 探讨前额叶皮层（PFC）树突棘及突触发育障碍，诱发自闭症（ASD）小鼠核心症状的机制。方法 将C57小鼠按照完全随机设计，分为正常对照组（CON组），ASD模型组（VPA组），溶剂对照组（DMSO组）和Wortmannin抑制剂组（Wortmannin组），10只/组。旷场实验，青年玩耍实验和三箱社交实验评价小鼠的ASD样行为；高尔基染色观察小鼠PFC树突棘密度的变化；Western blot检测小鼠PFC信号通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR以及突触相关蛋白PSD95、p-Syn、Syn的表达；免疫荧光染色观察PSD95、p-Syn的变化。结果 与CON组相比，VPA组小鼠出现了ASD样表型，PFC总的、成熟型树突棘密度减少（P<0.05），未成熟型树突棘密度增加（P<0.01），信号通路相关蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR表达上调（P<0.05），突触相关蛋白PSD95和p-Syn/Syn表达下调（P<0.01或P<0.001）。Wortmannin能改善小鼠ASD样表型，改善树突棘发育，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路及上调突触相关蛋白的表达。结论 PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度激活和突触相关蛋白PSD95、p-Syn表达降低可能导致VPA诱导的ASD小鼠PFC树突棘损伤和突触发育障碍，最终导致ASD样表型。

• 活性氧与铁死亡通路相互作用在丙酮醛引起的小鼠胚胎成骨细胞损伤中起重要作用

  冯苑仪, 羊冬梅, 智喜梅, 邓海鸥, 张伟杰, 王瑞雪, 吴 文

  目的 探讨活性氧和铁死亡在丙酮醛诱导小鼠胚胎成骨细胞（MC3T3-E1）损伤中是否存在相互作用。方法 应用丙酮醛损伤MC3T3-E1细胞建立模拟糖尿病骨质损伤的细胞模型。应用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定MC3T3-E1细胞的存活率；罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位；双氯荧光素（DCFH-DA）荧光显微镜照相法检测胞内活性氧水平；碱性磷酸酶试剂盒检测定碱性磷酸酶活性；茜素红染色观察成骨细胞晚期标志物-矿化结节的形成；铁离子试剂盒检测铁离子水平；Western blot检测成骨细胞的抑制铁死亡的标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达水平。结果 0.6 mmol/L 丙酮醛处理MC3T3-E1细胞24 h可明显减少GPX4的表达（P<0.001），同时可使胞内铁离子浓度升高，细胞存活率降低，线粒体膜电位丢失，胞内活性氧水平升高，碱性磷酸酶活性降低和矿化结节减少（P<0.001）。应用2 mmol/L 活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸和丙酮醛共处理MC3T3-E1细胞24 h可增加GPX4的表达（P<0.01），应用4 μmol/L铁死亡抑制剂铁抑素-1与丙酮醛共处理成骨细胞24 h可使胞内活性氧水平降低（P<0.001）；应用N-乙酰半胱氨酸或铁抑素-1与丙酮醛共处理成骨细胞24 h均能对抗丙酮醛引起的上述其他细胞损伤（P<0.001）。结论 活性氧与铁死亡通路相互作用在丙酮醛引起MC3T3-E1成骨细胞损伤中起重要的作用。

• 天麻素注射液通过NGF/TrkA通路减轻大鼠脑缺血所致肺损伤

  产翠翠, 马同军, 王继胜, 张雨微, 龚 鑫

  目的 基于神经生长因子（NGF）/酪氨酸激酶受体A（TrkA）通路探讨天麻素注射液治疗局灶性脑缺血致肺损伤大鼠的作用机制。方法 将40只SD大鼠随机分为4组：正常组、假手术组、模型组和天麻素治疗组（10只/组）。采用栓塞大鼠右侧大脑中动脉复制局灶性脑缺血模型，造模成功后，用天麻素注射液腹腔注射10 mg/kg，1次/d，持续14 d；假手术组和模型组大鼠不予治疗。治疗结束后，测定大鼠肺组织湿/干重比值，HE染色检测肺组织病理变化，ELISA法检测动脉血液中炎性因子（IL-10、TNF-α）的含量，Western blot检测肺组织NF-κB p65、TNF-α的表达，免疫组织化学染色法及蛋白质免疫印迹试验检测肺组织NGF、TrkA的表达。结果 与正常组和假手术组相比，模型组呈现出明显的炎症性肺损伤病理表型，肺湿/干重比值增加（P<0.01），动脉血中TNF-α浓度增高（P<0.01），肺组织内NF-κB p65（P<0.01）、TNF-α（P<0.01）、NGF（P<0.05）和TrkA（P<0.05）蛋白表达水平上升；与模型组相比，天麻素治疗组肺部炎性病理变化减轻，肺湿/干重比值降低（P<0.05），动脉血中TNF-α浓度降低（P<0.01），IL-10浓度增高（P<0.01），肺组织内NF-κB p65和TNF-α蛋白表达水平降低（P<0.05），肺组织内NGF和TrkA蛋白表达水平增加（P<0.05）。结论 脑缺血可引起炎症性肺损伤，NGF/TrkA通路可能参与了炎症反应的发生过程；天麻素注射液可减轻脑缺血大鼠的肺损伤，其机制可能与NGF/TrkA通路激活抗炎途径有关。

• HYAL2基因 DNA 甲基化水平可用于甲状腺良恶性肿瘤的鉴别诊断

  殷益飞, 李 红, 杨春生, 张敏敏, 黄选东, 李梦夏, 杨蓉西, 张正东

  目的 通过比较甲状腺良恶性肿瘤组织样本中HYAL2基因CpG位点甲基化水平的差异，评估其作为甲状腺癌鉴别诊断分子标志物的潜在价值。方法 采用飞行时间质谱检测 190对甲状腺乳头状癌（PTC）病例和年龄、性别配对的甲状腺腺瘤中HYAL2基因启动子区域CpG位点的甲基化水平。采用免疫组化检测另外55对匹配的甲状腺良恶性肿瘤患者的HYAL2蛋白表达水平。Logistic回归分析用于评估甲基化水平每降低10%与早期PTC之间的关联并计算比值比（OR）。受试者工作特征曲线及曲线下面积（AUC）用于评估HYAL2基因特定CpG位点甲基化水平改变作为分子标志物的效能。结果 HYAL2_CpG_3位点低甲基化与早期PTC显著相关（OR=1.51，P=0.001），且该关联在Ⅰ期PTC中依旧显著（OR=1.42，P=0.007）。年龄分层分析显示HYAL2_CpG_3甲基化水平降低与早期PTC关联在年龄小于50岁的人群中显著高于高年龄组（OR：1.89 vs 1.37；P<0.05），且低年龄组人群中AUC最高，为0.787。免疫组化结果显示早期PTC中HYAL2蛋白表达水平显著高于甲状腺良性肿瘤。结论 HYAL2基因启动子区域甲基化水平改变与早期PTC的关联，并为DNA甲基化改变作为甲状腺良恶性肿瘤鉴别诊断的标志物提供了新思路。

• 列线图可预测首发缺血性脑卒中患者的复发

  刘 瑾, 杨燕玲, 严 可, 朱彩蓉, 蒋 敏

  目的 探索影响首发缺血性脑卒中幸存者复发的危险因素，建立复发预测模型并使用列线图将预测结果可视化。方法 收 集2010年1月~2018年12月入住四川大学华西医院神经内科且符合纳入标准的首发缺血性脑卒中幸存者，共821例幸存者纳入研究，利用R软件对初始人群进行随机抽样，70%纳入训练集建立模型，30%纳入验证集。应用Cox比例风险回归模型对影响首发缺血性脑卒中幸存者复发的因素进行多因素分析，并使用R软件的rms包构造列线图，建立可视化的预测模型。利用C-index和校准曲线来评价模型的预测效果。结果 821例幸存者中，患者3年复发率为16.81%，5年复发率为19.98%；训练集经Cox回归模型多因素分析，年龄>65岁（HR=2.596，P=0.024）、年龄45~64岁（HR=2.510，P=0.006）、mRS评分≥3分（HR=2.284，P=0.004）、冠心病史（HR=1.353，P=0.034）是影响复发的危险因素；并由此建立列线图，3年（5年）复发预测模型的C-index为 0.640（0.671）。结论 首发缺血性脑卒中幸存者复发的影响因素是年龄、mRS评分和周围血管病史，列线图在首发缺血性脑卒中复发预测中有较高的区分度和预测力。

• 中国和英国子宫内膜异位症患者的发病相关因素分析

  聂伟哲, 李舒婷, Krina T. Zondervan, Christian M. Becker, 郭逸男, 宗利丽

  目的 研究子宫内膜异位症发病的相关因素及其在中国和英国患者之间可能的差异。方法 采用病例对照研究方法，选取英国牛津John Radcliffe Hospital收治的子宫内膜异位症患者387例和非子宫内膜异位症患者199例、广州中医药大学第一附属医院收治的子宫内膜异位症患者101例和非子宫内膜异位症患者50例分别为病例组和对照组。通过标准化的WERF EPHect调查问卷，收集4组人群的身高、体质量、体质量指数、婚姻状况、工作状况、月经情况、生育情况、手术原因等临床资料并进行统计分析。结果 多因素Logistic回归分析结果显示，英国患者中体质量指数、因痛经进行手术、怀孕史、既往子宫内膜异位症手术次数、工作情况等均与子宫内膜异位症的发生相关（P<0.05），而中国患者中痛经史与子宫内膜异位症的发生相关（P<0.05）。结论 痛经可能是中国和英国子宫内膜异位症患者最主要的相关因素；同时，子宫内膜异位症发生的相关因素在中国和英国患者之间可能存在差异。

• MicroRNA-132通过诱导线粒体氧化应激障碍-铁死亡进程促进动脉粥样硬化

  刘泽鑫, 曹 赛, 陈 清, 符方勇, 程梅容, 黄显莹

  目的 探讨MicroRNA-132（miR-132）在动脉粥样硬化斑块中的表达及生物学意义。方法 收集在本医院行外周血管造瘘手术的动脉粥样硬化患者的斑块样本及周围正常血管样本各30例，分为实验组（n=30）与对照组（n=30）；利用RT-qPCR验证miR-132在30例组织标本中的表达水平；采用脂质体转染技术上调人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中miR-132的表达，继而通过流式细胞及激光共聚焦技术分析过表达miR-132的HUVEC内活性氧（ROS）、ROS与线粒体的定位关系、线粒体活性氧超氧化物（mtROS）、线粒体膜电位状态（MMP）以及线粒体膜转换孔通透性（mPTP）的功能变化；通过ELISA检测HUVEC内线粒体氧化还原呼吸链复合体（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型）活性的状态；通过Western blot检测铁死亡关键蛋白的表达水平。结果 与正常血管样本（对照组）相比，miR-132在动脉粥样硬化斑块的表达水平显著上调（P<0.001）；相比于正常HUVEC，脂质体转染的HUVEC内miR-132表达量显著上升（P<0.001），细胞内ROS明显增加（P<0.001），且大部分ROS与线粒体存在共定位关系；同时于正常HUVEC，miR-132过表达的HUVEC细胞内MMP下降（P<0.001）、mtROS升高（P<0.001）、线粒体活性氧mPTP更多开放（P< 0.001），继而引起线粒体氧化还原呼吸链应激障碍，铁死亡关键蛋白GPX4显著下调（P<0.001）、氧化蛋白NOX4显著增多（P< 0.001）。结论 MiR-132可通过诱导线粒体氧化应激障碍-铁死亡进程促进动脉粥样硬化，有望成为动脉粥样硬化的治疗靶点。

• 《中国药典》（2010年版~2020年版）中药指纹（特征）图谱应用进展与展望

  鄢海燕, 邹纯才

  《中国药典》2010年版开始将指纹（特征）图谱用于中药的质量控制，《中国药典》2015年版和《中国药典》2020年版均新增了指纹（特征）图谱，完善了以《中国药典》为核心的国家药品标准。本文从收载品种数及指纹（特征）图谱应用情况、评价方法、测定方法的选择、供试品提取或制备溶剂的选择等几个方面对《中国药典》（2010年版~2020年版）中药指纹（特征）图谱进行了归纳、整理与分析，发现指纹（特征）图谱在得到更广泛应用的同时，评价指标也在不断完善。同时，从选择合适的提取或制备溶剂获得药效物质是指纹（特征）图谱建立的基础、基于不同功能主治或基源建立一药多谱是指纹（特征）图谱的有效拓展、增加中药指纹（特征）图谱技术指导原则是规范指纹（特征）图谱使用的保障、指纹（特征）图谱的修订更新与应用延伸是指纹图谱活力体现等几个方面对指纹（特征）图谱进行了展望，以期推动中药指纹（特征）图谱在中药质量控制中发挥更大作用。

• 中国基层医院如何开展腹腔镜肝切除术：术前规划、术中技巧和术后管理

  潘明新, 张 成

  目前，随着腹腔镜肝切除术在各大医疗中心广泛发展和应用，国内外有指南总结了手术的适应症、技术要点和操作流程等。但是，基层医院在具备一定硬件设备的基础上，仍处于开展例数较少、进展缓慢的阶段，其原因在于手术思想观念未转变、腔镜切肝的解剖理论知识欠缺、腔镜切肝围手术期多学科合作不紧密以及腹腔镜技术水平不足等。本文针对腹腔镜肝切除术的术前规划、术中技巧以及术后管理3个方面进行阐述：术前充分了解肝脏解剖结构，并根据手术难度和自身条件选择合适的病例；术中做到选择合适的体位和戳卡布局，与麻醉科紧密合作控制良好中心静脉压，掌握肝脏悬吊牵拉技术以及超声刀使用技巧，选择正确的出血处理技巧和出入肝血流控制技术；术后采用加速康复外科管理。基层医院可通过借鉴上述经验，加速腹腔镜肝切除术的推广和应用。