南方医科大学学报杂志

南方医科大学学报杂志2022年第6期

• IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

  李星月, 尹丹旸, 范梦恬, 杨玉有, 梁 利, 冯乃波, 李小丽, 郭风劲

  目的 探究肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法 衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2，Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组），Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞，qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA 水平，Western blot 检测 IRE1α/p- IRE1α、CHERP 表达水平，流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素 A1 （Bafilomycin A1）处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1 组），Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α，免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后，内质网应激相关标志蛋白表达上调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05），p62表达下调（P<0.05）。相较对照组，Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001），4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组，原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后，ERN1（P<0.01）、ATG5（P<0.001）、ATG7（P<0.001）mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01），CHERP蛋白表达上调（P<0.05），胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素 A1 处理原代软骨细胞后，Control+Bafilomycin A1 组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01），ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后，ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度，过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白，升高胞内钙离子含量，进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。

• 食管癌患者术后预测模型的构建和验证：基于SEER数据库

  罗 钞, 王高明, 胡力文, 强 勇, 郑 超, 申 翼

  目的 构建用于预测食管癌患者术后远期生存的列线图。方法 从监测、流行病学和最终结果（SEER）数据库中确定了2004~2016年7215例食管癌患者。使用自助重抽样方法，共有5052名患者被分配到训练队列，其余2163名患者被分配到内部验证队列，同时纳入2014~2016年就诊于东部战区总医院心胸外科的435名食管癌患者进行外部验证。结果 在整个队列中，1 年、3年、5年的癌症特异性死亡率分别为14.6%、35.7%、41.6%。多因素Cox分析显示年龄（≥80岁 vs<50岁，P<0.001）、性别（男vs女，P<0.001）、肿瘤部位（下段vs中段，P=0.013）、病理分期（腺癌vs鳞癌，P=0.012），分化程度（差分化vs分化良好，P<0.001），TNM分期（IV vs I，P50 mm vs 0~20 mm，P<0.001），化疗（是vs否，P0.25 vs 0，P< 0.001）是食管癌患者术后远期生存的独立危险因素，并基于该模型构建了列线图，用于预测患者术后1年、3年、5年的存活概率。在训练队列中，用于预测总生存率（OS）和癌症特异性生存率（CSS）的列线图C指数分别为0.726（95%CI:0.714-0.738）和 0.735（95%CI:0.727-0.743）。列线图在内部验证队列和外部验证队列中得到了很好的验证，内部验证队列中预测OS和CSS的 C指数分别为0.752（95% CI:0.738-0.765）和0.804（95% CI:0.790-0.817），外部验证队列中预测OS和CSS的C指数分别为0.749（95%CI:0.736-0.767）和0.788（95%CI:0.751-0.808）。根据ROC曲线下面积（AUC），在预测食管癌远期预后中，该列线图显示出比肿瘤淋巴结转移（TNM）分期系统更高的敏感性。结论 构建的临床预测模型有较高的预测效能，能够有助于鉴别术后高危食管癌患者，可以作为TNM分期系统的补充。

• 益气解毒方治疗原发性肝癌的作用机制：基于网络药理学及分子对接方法

  徐 朦, 张 鹏, 张国梁

  目的 通过网络药理学及分子对接探究益气解毒方的有效成分及其作用于原发性肝癌的主要生物过程及信号通路，阐明益气解毒方治疗原发性肝癌的作用机制。方法 通过TCMSP、Uniport、Genecards、String等数据库，以及Cytoscape3.8.2软件得出药物、疾病最终靶点基因；通过David数据库对药物-疾病共有基因做GO、KEGG富集分析；通过Pubcham、RCSB、Autoduck将药物有效成分与最终核心基因进行分子对接；通过细胞活力检测、Western blot、实时荧光定量PCR实验研究不同浓度的益气解毒方对于核心基因DHX9、HNRNPK、NCL、PABPC1表达的影响。结果 筛选得出8个最终核心基因：DDX5、HNRNPK、PABPC1、DHX9、RPS3A、RPS3、RPL13、NCL。GO分析显示：主要生物过程为Ephrin receptor signaling pathway、Movement of cell or subcellular component、Blood microparticle、Focal adhesion、Iron ion binding；KEGG分析显示：Ras信号通路的基因数最多。分子对接结果显示药物有效成分与最终核心基因均可以在自然条件下进行对接，其中PABPC1与Stigmasterol结合能最高。Western blot、实时荧光定量PCR实验结果显示，当含药血清浓度逐渐增大时，细胞活力逐渐受到抑制（P<0.01），HepG2中蛋白相对表达量逐渐降低（P<0.05）；HepG2中蛋白的mRNA相对表达量逐渐增高（P<0.05），HepG2+10%含药血清培育48 h对HepG2 中 DHX9、HNRNPK、NCL、PABPC1 表达影响最明显（P<0.05）。结论 益气解毒方通过多种有效成分与 DHX9、HNRNPK、NCL、PABPC1的结合，调节原发性肝癌的的病毒表达，从而治疗原发性肝癌。

• 肝细胞癌进展过程中的关键基因ATP1B3和ENAH的筛选与鉴定：基于数据挖掘和临床验证

  杨雪佳, 李玉杰, 吴登强, 马义丽, 周素芳

  目的 筛选与肝细胞癌（HCC）预后、进展和临床诊断相关标记物。方法 分析来自癌症基因组图谱数据库（TCGA）和基因表达综合（GEO）的TCGA-LIHC、GSE84432、GSE14323和GSE63898数据集。利用GEO2R和edge R包获得各疾病类型之间共同差异基因（DEG），并对DEG进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。将DEG在TCGA-LIHC中正常和癌组织进行差异表达验证分析，挑选在HCC中上调基因。利用R语言进行生存分析、受试者工作特征（ROC）曲线分析、基因与患者临床特征关系分析。再通过RT-qPCR验证15对临床HCC和癌旁组织中基因的差异表达。结果 数据库挖掘共获得118个共同DEG，挑选出2个基因：ATP酶Na+/K+转运亚基Beta 3（ATP1B3）和肌动蛋白调节器（ENAH），其表达随疾病进展升高。结合TCGA-LIHC数据集生存分析发现两者高表达与HCC患者不良预后显著相关（P<0.05）。ROC曲线分析ATP1B3和ENAH的AUC值分别是0.821和0.933。ATP1B3高表达与晚期病理T分期、Stage和Grade相关（P<0.05），而ENAH高表达仅与晚期病理Grade有关（P<0.05）。RT-qPCR结果发现，ATP1B3和ENAH在临床HCC组织中表达上调（P<0.05）。结论 ATPIB3和ENAH有望成为肝脏疾病恶化和肝细胞癌的不良预后标志物。

• 旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对脓毒症诱发的小鼠心肌损伤有保护作用

  袁 圆, 年 峰, 李徽徽, 杨慧娟, 吴玉芝, 马梦禧, 汪开贵, 陈雪玲, 张自强, 栗 根, 杨小迪, 吴 强

  目的 观察旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白（Ts-MES）对脓毒症诱发的小鼠心肌损伤的保护作用。方法 80只雄性BALB/c小鼠随机分为4组，各组20只，分别为假手术组（A组）、心肌损伤模型组（B组）、Ts-MES治疗组（C组）和地塞米松对照组（D组）。B、C、D组采取盲肠结扎穿孔术构建脓毒症诱发的心肌损伤小鼠模型，A组只行开腹探寻，不结扎和穿刺盲肠。术后40 min，A、 B组腹腔注射150 μL PBS，C组腹腔注射含20 μg Ts-MES的等量PBS，D组腹腔注射含地塞米松（0.3 mg/kg）的等量PBS。术后12 h，每组随机抽取6只小鼠进行超声心动图检测，另抽取8只用于观察72 h生存率。剩余的6只小鼠通过HE染色评价心肌病理变化，ELISA法检测血清中NTPro-BNP和cTnI水平，ELISA法和qRT-PCR法分别检测血清和心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β的表达。结果 B组小鼠的心功能指标（LVEF、LVFS、E/A）及72 h生存率较A组显著下降（P<0.001），心肌病理损伤评分及血清中NTPro-BNP和cTnI水平明显升高（P<0.01）；与B组相比，C、D两组小鼠的心功能指标和72 h生存率明显回升（P<0.05），心肌病理损伤评分及血清中NTPro-BNP和cTnI水平明显降低（P<0.05）。小鼠血清和心肌组织中TNF-α和IL-6水平比较：B组小鼠血清和心肌组织中TNF-α和IL-6水平较A组显著升高（P<0.001），C、D两组较B组显著下降（P<0.05）；IL-10和TGF-β水平：C组较B组显著升高（P<0.05），D组较B组虽有增高但无统计学差异。结论 Ts-MES可抑制促炎细胞因子的表达并促进调节性细胞因子的表达，进而保护脓毒症诱发的小鼠心肌损伤。

• 投影插值联合物理校正的自适应CT金属伪影消除算法

  朱其森, 王永波, 朱曼曼, 陶 熙, 边兆英, 马建华

  目的 为去除CT图像中的金属伪影,提升CT图像质量，本文提出一种结合投影插值和物理校正的自适应加权CT金属伪影消除算法。方法 采用归一化金属投影插值算法得到初始校正投影数据，在此基础上引入金属物理校正模型得到物理校正投影数据，通过自适应权重加权融合两者投影得到最终的校正投影，最后经过滤波反投影重建获得最终校正图像。为验证本文算法的有效性，采用仿真数据和临床数据进行实验。对于仿真数据本文采用PSNR和SSIM定量指标进行评估，而临床数据采用影像专家对结果图像评分方式来比较不同方法的伪影消除性能。结果 在仿真数据实验中，与对比方法结果相比，本文方法结果的PSNR定量指标至少提升了0.2 dB且获得最高SSIM定量指标。影像专家评分结果显示本文方法在临床数据中获得最高的评分结果3.616±0.338（5分制），与对比方法之间的伪影消除性能差异具有统计学意义（P<0.001）。结论 本文提出的金属伪影消除算法，可有效去除金属伪影，同时保持更多的组织结构信息，减少新伪影的产生。

• 抑制Sonic Hedgehog信号能抑制脑缺血性损伤后纤维瘢痕形成且不利于神经功能恢复

  文 君, 朱慧敏, 李雪梅, 黄家贵, 陈 月, 杨 琴

  目的 探讨抑制Sonic Hedgehog（Shh）信号对脑缺血性损伤后纤维瘢痕形成及神经功能的影响。方法 构建体内成年SD大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型和体外新生24 h SD大鼠脑膜原代成纤维细胞氧糖剥夺/再复氧（OGD/R）模型。成年SD大鼠随机分成假手术组、缺血/再灌注组（I/R）、缺血再灌注腺病毒空载（rAd-NC）组和缺血再灌注腺病毒敲低Shh（rAd-ShShh）组。SD大鼠脑膜原代成纤维细胞随机分成正常组、缺血对照组、肿瘤生长因子-β1预处理组（TGF-β1）、TGF-β1预处理加环王巴明组（TGF-β1+CYC）。每组细胞被预处理24 h经OGD/R 150 min后复氧72 h。采用改良神经严重程度评分（mNSS）、改良Bederson评分评估神经功能缺损。CCK-8法测定细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，免疫荧光法检测缺血中心纤维连接蛋白（Fn）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Shh的表达，TUNEL染色检测缺血中心细胞凋亡，实时荧光定量PCR（qPCR）法检测缺血中心Fn、α-SMA及Shh mRNA的表达，WB法检测OGD/R后成纤维细胞Shh、α-SMA蛋白的表达。结果 体内实验中免疫荧光法及qPCR法结果显示与假手术组相比SD大鼠MCAO/R后可诱导缺血侧大脑半球Shh、α-SMA 、Fn蛋白和mRNA的表达升高（P<0.05）。而与MCAO/R组相比，rAd-Shshh组缺血侧大脑半球Shh、α-SMA、Fn蛋白和mRNA的表达降低（P<0.05），缺血侧组织细胞的凋亡增加（P<0.05），改良神经严重程度评分（mNSS）、改良Bederson评分增高（P<0.05）。体外研究中CCK-8实验显示与正常组和缺血对照组相比TGF-β1组A值升高（P0.05）。细胞划痕实验结果显示与正常组和缺血对照组相比在24 h内TGF-β1组成纤维细胞的迁移距离增加（P<0.05），而TGF-β1+CYC组与TGF-β1组相比成纤维细胞的迁移距离减少（P<0.05）。免疫荧光实验、Western blot及qPCR显示与正常组和缺血对照组相比TGF-β1组细胞Shh、α-SMA和Fn的表达升高（P<0.05），而TGF-β1+CYC组与TGF-β1组相比Shh、α-SMA和Fn的表达降低（P<0.05）。结论 抑制Shh信号能抑制脑缺血性损伤早期纤维瘢痕的形成且不利于神经功能的恢复。

• 基于噪声水平估计的低剂量螺旋CT投影数据恢复

  和法伟, 王永波, 陶 熙, 朱曼曼, 洪梓璇, 边兆英, 马建华

  目的 构建任意低剂量水平下螺旋CT投影数据恢复模型。方法 首先，利用噪声估计模块估计任意低剂量水平的投影数据噪声方差图；然后利用估计出的噪声方差图指导投影数据进行恢复，即投影数据恢复模块；最后，采用滤波反投影算法进行图像重建。其中，噪声估计和投影数据恢复模块采用三维小波残差密集群网络结构，并利用非对称损失和全变分正则化进行约束。为验证方法的有效性，利用不同恢复模型分别对1/10、1/15常规剂量CT图像进行恢复，并与现有CT图像恢复网络IRLNet、REDCNN、MWResNet进行对比实验。 结果 在定量指标对比方面，本文提出的螺旋CT投影数据恢复方法相比于其他图像域恢复方法，结构相似性提升5.79%~17.46%（P<0.05）；临床影像医师图像质量评分结果显示，评分比其他方法高7.19%~17.38%（P<0.05）。结论 本文提出的投影数据恢复模型能够有效抑制不同低剂量水平投影数据中的噪声和伪影，重建得到组织结构完整、高分辨率的CT图像。

• 血管紧张素转化酶2参与臭氧暴露导致的小鼠肺部炎症及气道重塑

  王月霞, 张 钰, 张 亮, 李梦圆, 朱培育, 纪望全, 梁若楠, 秦露伟, 吴卫东, 冯斐斐, 晋乐飞

  目的 研究血管紧张素转换酶2（ACE2）在臭氧暴露致小鼠肺部炎症及气道重塑中的作用。方法 16只野生型（WT）C57BL/6J小鼠和16只ACE2 敲除（KO）小鼠分别暴露于空气和臭氧（0.8 ppm）中，每天暴露3 h，连续暴露5 d。分别设置AirWT组，Air KO组，Ozone WT组和Ozone KO组。Masson染色观察小鼠肺组织胶原沉积情况，HE染色观察小鼠肺部病理学改变，并进行评分；收集小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF），并进行细胞计数；分别采用BCA法和酶联免疫吸附法（ELISA）测定BALF总蛋白和细胞因子浓度；荧光定量PCR检测肺组织中气道重塑相关指标的mRNA表达；小鼠的气道阻力采用小动物呼吸机测量（乙酰甲胆碱激发）。结果 臭氧暴露ACE2 KO小鼠肺组织炎症病理学变化总分显著高于臭氧暴露WT小鼠（P<0.05）。Masson染色结果显示，臭氧暴露小鼠肺组织支气管和肺泡周围有大量的胶原沉积，臭氧暴露ACE2 KO小鼠肺组织的支气管和肺泡的胶原沉积阳性区域面积为（19.62±3.16）%、（21.63±3.78）%，高于臭氧暴露 WT 小鼠肺组织的（6.49±1.34）%、（4.44± 0.99）%，两者差异具有统计学意义（P0.05）。臭氧暴露ACE2 KO小鼠BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α、趋化因子（C-X-C基序）配体1（CXCL1/KC）和单核细胞趋化蛋白（MCP-1）水平均高于臭氧暴露WT小鼠，其中IL-1β水平的变化差异具有统计学意义（P<0.05）。臭氧暴露 ACE2 KO 小鼠的肺组织中的基质金属蛋白酶 9（MMP-9）、MMP-13、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP4）、Ⅰ型胶原α1 （COL1A1）、TGF-β的mRNA水平均明显高于WT组小鼠，两组的MMP-9、TIMP4、COL1A1、TGF-β的mRNA水平差异具有统计学意义（P0.05）。结论 ACE2参与臭氧暴露导致的小鼠肺部炎症及气道重塑。

• 分化可控的人类鼻粘膜类器官模型的建立

  汪 珂, 于 言, 韩 日, 王显文, 赵云腾, 唐浩程, 李 刚

  目的 建立分化程度可控、能够重现来源组织结构和功能的人类鼻粘膜类器官模型。方法 采集手术切除的新鲜中鼻甲和鼻息肉组织，将消化过滤的鼻粘膜上皮细胞分为连续“扩增”培养组（EO组）及“扩增-分化”分段培养组（DO组）。分别在基于气液界面进行体外3D类器官培养，通过STR鉴定、电镜及免疫组化染色分别对两组鼻粘膜类器官的结构、细胞组成及纤毛功能进行鉴定。再通过PAS染色对DO组中分化后的鼻粘膜类器官分泌功能进行鉴定。结果 整个培养期间，均能生长出直径逐渐增大的空泡状或实心球状3D类器官。培养第16天，DO组多为空泡状类器官，EO组多为实心球状类器官，DO组空泡数比例大于EO组（[ 21.67±8.57）% vs（54.67±13.26）%，P<0.05]。将鼻粘膜类器官与来源组织同时进行STR检测，匹配度为100%。培养第21天，DO组鼻粘膜类器官扫描及透射电镜显示纤毛超微结构，而EO组多显示出短绒毛结构。免疫组化染色结果显示，呼吸区粘膜主要包含P63（基底细胞）、β-tubulin（纤毛柱状细胞）、MUC5AC（杯状细胞）。相比EO组，DO组类器官纤毛细胞数[(7.95± 1.81)% vs (27.04±5.91)%，P<0.05]及杯状细胞数[(14.46±0.93)% vs (39.85±5.43)%，P0.05）。DO组中分化后的鼻粘膜类器官糖原染色呈阳性表达。结论 本研究首次采用“扩增-分化”分段式培养法，培养出能够在体外长期稳定生长、高度拟似来源组织形态结构和功能（纤毛功能及分泌功能），且分化程度可控的鼻粘膜类器官。

• 补骨脂乙素通过多途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞死亡

  张玉心, 高美佳, 朱美林, 李红梅, 马 涛, 吴成柱

  目的 探究补骨脂乙素（IBC）对人乳腺癌MCF-7细胞死亡的作用及其可能机制。方法 使用不同浓度IBC处理MCF-7细 胞24、48、72 h后，用MTT法检测IBC对MCF-7细胞增殖的影响；将MCF-7细胞设置10、20、40 μmol/L IBC处理组，用AnnexinV-FITC/PI双染结合流式细胞仪、荧光显微镜检测IBC对MCF-7细胞凋亡的影响；免疫印迹法检测凋亡、自噬相关蛋白（Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、p62、LC3）表达的变化；透射电镜观察40 μmol/L IBC处理MCF-7后的细胞亚显微结构；利用JC-1试剂盒、ATP试剂盒和活性氧试剂盒检测IBC对细胞线粒体功能的影响。结果 MTT实验结果显示，IBC具有抑制MCF-7细胞增殖的作用，并呈现浓度和时间依赖性，其作用24、48、72 h的IC50值分别为38.46、31.31、28.26 μmol/L。IBC诱导MCF-7细胞发生凋亡，呈现浓度依赖性。预处理凋亡抑制剂z-VAD-fmk后，其细胞存活率显著高于单独处理IBC组（P<0.05），而程序性坏死抑制剂Nec-1没有保护作用。免疫印迹结果显示IBC增加促凋亡蛋白Bax（P<0.05）表达，下调Bcl-2（P<0.05）、Akt（P<0.05）及其Ser-473位的磷酸化水平（P<0.05）而诱导凋亡。同时，随着IBC浓度的增加，自噬相关蛋白p62的表达逐渐增加，LC3-II/I比值升高，透射电镜下也观察到IBC处理的MCF-7细胞胞浆内有自噬泡以及自噬小体。试剂盒检测到IBC导致线粒体膜电位降低、细胞内ATP水平下降、产生和积聚活性氧（ROS）（P<0.05）。结论 IBC诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡和自噬等多种死亡形式，可成为今后抗乳腺癌创新药物研发的先导化合物。

• 血清肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、SCCAg、NSE、ProGRP在不同病理分型肺癌诊断中的应用价值

  高 洁, 张伦军, 彭 珂, 孙 红

  目的 探讨癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19的可溶性片段（CYFRA21-1）、鳞状细胞癌抗原（SCCAg）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胃泌素释放肽前体（ProGRP）在不同病理分型肺癌诊断中的应用价值。方法 选取临床诊断明确的肺腺癌（LADC）患者137例，肺鳞癌（LSCC）患者82例，小细胞肺癌（SCLC）患者59例，肺部良性病变（BCD）患者102例。检测所有患者血清肿瘤标志物，对比阳性率及浓度水平，采用ROC曲线进行分析，计算单独及联合检测的诊断效能。结果 LADC组CEA阳性率及浓度水平高于其他组（P<0.05），LSCC组SCCAg阳性率及浓度水平高于其他组（P<0.05），SCLC组ProGRP、NSE阳性率及浓度水平高于其他组（P0.05）。结论 CEA、CYFRA21-1、SCCAg、NSE、ProGRP与肺癌病理分型相关，可作为肺癌诊断的相关指标。

• 颈动脉斑块内新生血管与PCI术后患者再次血运重建具有相关性

  韩艳艳, 费 翔, 任 玲, 汪晶晶, 陈 韬, 郭 军, 汪 奇

  目的 应用超声造影（CEUS）评估经皮冠状动脉介入治疗术（PCI）后患者颈动脉斑块内新生血管（IPN）与再次血运重建之间的关系。方法 选取105名PCI术后≥12月随访患者，接受CEUS检查，观察斑块形成情况及IPN，并根据患者是否接受再次血运重建分为再次血运重建组（REV，n=27）和非再次血运重建组（N-REV，n=78）。应用受试者工作特征曲线评价CEUS相关参数预测PCI术后再次血运重建的诊断效能，logistic回归分析危险因素。结果 REV组患者IPN 0分、1分、2分、3分分别为1（3.7%）、8（29.6%）、15（55.6%）、3（11.1%）。两组间斑块长度（15.70±6.93 vs 12.10±6.64，P<0.05）、斑块最大厚度（3.69±1.12 vs 3.14±1.18，P<0.05）、IPN（1.74±0.71 vs 0.87±0.63，P<0.001）差异具有统计学意义。IPN与PCI术后再次血运重建显著相关，logistic回归分析表明IPN是PCI术后再次血运重建的独立危险因素。选取IPN=1.5为截断值时，PCI术后患者发生再次血运重建的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为74%、89%、69%、91%，其曲线下面积为0.848（95% CI：0.703~0.905，P<0.001）。结论 CEUS可以无创的半定量评估PCI术后患者颈动脉斑块内新生血管情况，IPN与PCI术后发生再次血运重建具有相关性，有一定的临床预测价值。

• 阿托伐他汀抑制脑胶质瘤细胞的增殖和促进凋亡：基于上调miR-146a表达与抑制PI3K/Akt信号通路

  崔 颖, 范顺志, 潘迪迪, 巢 青

  目的 探究阿托伐他汀（AVT）对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响及其对miR-146a/PI3K/Akt信号通路的作用。方法 将人脑胶质瘤细胞U251分为4组：对照组（Conrtrol）、AVT组、AVT+转染miR-146a无关片段组（AVT+miR-146a NC）、AVT+转染miR-146a干扰组（AVT+miR-146a inhibitor）。Control组不加任何药物，AVT组加入8.0 μmol/L 的AVT，AVT+miR-146a NC组转染miR-146a NC后加入8.0 μmol/L 的AVT，AVT+miR-146a inhibitor组转染miR-146a inhibitor后加入8.0 μmol/L 的AVT。RT-PCR检测miR-146a表达，MTT检测细胞增殖率，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Transwell实验检测细胞侵袭和迁移情况，Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。结果 药物干预48 h，与Control组相比，AVT组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显升高（P<0.01），细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显降低（P<0.01）。与AVT组相比，AVT+miR-146a inhibitor组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显降低（P<0.01），细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K 和p-Akt蛋白表达均明显升高（P0.05）。结论 AVT能够抑制人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡，其机制与上调miR-146a表达，抑制PI3K/Akt信号通路相关。

• 柴胡桂枝汤加减方联合卡培他滨抑制三阴性乳腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长：基于抑制IL-6/STAT3信号通路

  方雨潇, 王淑美, 杨 倩, 游松凡, 幸享玲

  目的 探讨柴胡桂枝汤加减方（CHGZD）联合卡培他滨对三阴性乳腺癌裸鼠皮下移植瘤生长及凋亡的影响及其作用机制。方法 建立三阴性乳腺癌移植瘤模型，随机分为模型对照（等体积双蒸水）组，CHGZD低（10.62 g/kg/d）、中（21.23 g/kg/d）、高（42.46 g/kg/d）剂量组，卡培他滨（0.2 mg/kg/d）组，联合组（CHGZD 42.46 g/kg/d+卡培他滨0.2 mg/kg/d），10只/组，干预21 d。观察小鼠一般情况，给药结束后测瘤体积、称瘤质量并计算抑瘤率；苏木素-伊红（HE）染色观察肿瘤组织病理学改变；ELISA检测血清中IL-6水平；实时荧光定量聚合酶链式反应、Western blot分别检测各组肿瘤组织中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白水平及肿瘤生长和凋亡相关基因Bax、Bcl-2和CyclinD1的表达。结果 与模型对照组比较，中药组和联合组乳腺癌荷瘤裸鼠摄食量增加，精神状态较好，反应灵敏，体质量增加，瘤体积、瘤质量显著降低（P<0.01）；与卡培他滨组比较，中、高剂量组及联合组抑瘤率显著升高（P<0.01）；与模型对照组比较，中、高剂量组及联合组肿瘤组织出现了不同程度的肿瘤细胞退变，肿瘤细胞密度明显减少；中药组和联合组IL-6水平，IL-6、STAT3 mRNA，IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白表达显著降低（P<0.05），其下游基因Bcl-2和CyclinD1 mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.05），Bax mRNA和蛋白表达显著升高（P<0.05）。结论 柴胡桂枝汤加减方与卡培他滨联用可显著抑制三阴性乳腺癌裸鼠体内肿瘤的生长，其作用机制可能为抑制IL-6/STAT3信号通路，调控Bax、Bcl-2和CyclinD1基因表达抑制细胞的增殖和分化，诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。

• 大黄素治疗类风湿关节炎的作用机制：基于网络药理学方法

  曹春浩, 曾 丽, 荣晓凤

  目的 基于网络药理学方法，运用在线数据库研究大黄素治疗类风湿关节炎的作用机制，并在成纤维样滑膜细胞细胞系中进行验证。方法 通过Targetnet、SwissTargetPrediction、Genecards、DisGeNET和OMIM数据库，分别获得大黄素作用靶点及类风湿关节炎相关基因，并构建靶点蛋白质相互作用网络（PPI），对交集基因进行Gene Ontology与KEGG通路富集分析。运用AutoDock4.2.6软件模拟分子对接。将大黄素与经TNF-α诱导的MH7A细胞共同培养，培养分组情况：空白对照组、模型组（TNF-α组，10 ng/mL）、药物干预组（TNF-α 10 ng/mL+Emodin20、40、60、80、100 μmol/L）。采用CCK-8法、细胞划痕实验及流式细胞周期实验探究大黄素对MH7A细胞增殖的抑制作用。通过Western blot观察其NF-κB通路蛋白表达情况，通过Rt-PCR实验分析 CAPS3、PTGS2（COX2）、MAPK14 基因的表达。结果 获得大黄素和类风湿关节炎交集基因32个，其中心节点为CAPS3、ESR1、MAPK14等，主要涉及NF-κB信号通路等。分子对接提示大黄素与核心靶点能较好的结合。实验结果显示，大黄素能明显抑制MH7A细胞过度增殖（P<0.05）。Western blot结果显示，TNF-α诱导的MH7A细胞NF-κB 蛋白表达水平升高（P<0.01），而予以大黄素80 μmol/L干预后IκBα、p-NF-κB表达水平均有所降低（P<0.01）。Rt-PCR结果显示，TNF-a组COX2、 P38MAPK（MAPK14）核心基因的表达量明显上调，而大黄素（80 μmol/L）处理后各组COX2、P38MAPK14的mRNA表达下降mRNA的表达下降（P<0.01），凋亡相关基因CASP3上调。结论 大黄素通过调控细胞增殖凋亡，调节NF-κB等信号通路等发挥治疗类风湿关节炎作用。

• 微血流成像能准确鉴别和诊断胆囊息肉样病变

  朱连华, 韩 鹏, 姜 波, 李 楠, 费 翔

  目的 探讨微血流成像（MFI）评价胆囊息肉样病变血流灌注特征及鉴别诊断的价值。方法 回顾性分析73例胆囊息肉样病变患者的临床资料和超声图像，根据病理结果分为肿瘤性息肉组（n=24）和非肿瘤性息肉组（n=49）。所有患者在胆囊切除术前均行常规超声、MFI和超声造影（CEUS）检查。比较彩色多普勒血流成像（CDFI）和MFI评价胆囊息肉样病变血流灌注特征的差异。运用加权Kappa一致性检验评估CDFI和MFI观察血流灌注特征与CEUS的一致性，并评价MFI在胆囊息肉样病变中的诊断效能。结果 MFI和CDFI在评价胆囊息肉样病变血流灌注特征方面差异具有统计学意义（χ2=37.684，P<0.001），MFI较CDFI能更准确显示息肉内血流灌注特征。CDFI和MFI对胆囊息肉样病变血流灌注特征评价与CEUS的一致性分别为0.118和0.816。MFI鉴别诊断肿瘤性息肉和非肿瘤性息肉的敏感性、特异性和准确性分别为75.00%、93.88%和87.67%。结论 MFI显示息肉的血流灌注特征与CEUS具有较好的一致性，其能准确鉴别诊断肿瘤性息肉和非肿瘤性息肉，为胆囊息肉样病变患者选择合适的治疗方式提供新的超声诊断依据。

• 低氧环境可体外促进人诱导多能干细胞分化为拟胚体

  方丽君, 冯子倍, 梅静怡, 周嘉辉, 林展翼

  目的 探讨人诱导多能干细胞向拟胚体分化过程中，生理性低氧环境在拟胚体悬浮和贴壁阶段的影响及其相关机制。方法 本研究中拟胚体悬浮阶段分为悬浮常氧组（21% O2）和悬浮低氧组（5% O2），贴壁阶段分为贴壁常氧组（21% O2）、贴壁低氧组（5% O2）、贴壁低氧组＋HIF-1α抑制剂Echinomycin。首先采用免疫荧光法鉴定人诱导多能干细胞的多能性，人诱导多能干细胞消化后分别在21%氧气和5%氧气条件下悬浮培养5 d，利用显微镜观察悬浮阶段拟胚体的形成和形态变化，5 d后检测拟胚体中三胚层标记基因的表达情况。接着分别取等量的拟胚体接种到明胶包被的培养皿，继续在21%和5%氧气条件下培养2 d，观察贴壁阶段拟胚体的粘附性能和粘附后向外周扩增速度的差异，检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况，随后在5%氧气条件下使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后，再次检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况。结果 常氧组和低氧组的拟胚体均具有三胚层分化的潜力。与常氧培养组相比，低氧组悬浮拟胚体周围的凋亡碎片明显减少，且较早出现囊性拟胚体，获得的拟胚体大小更加均匀一致。此外，低氧组的拟胚体贴壁数量明显高于常氧组（P<0.05），拟胚体贴壁后向外生长的速度明显快于常氧组（P0.05），而β-catenin和VEGFA的mRNA显著上调（P<0.05）；在蛋白质水平，低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达均上调（P<0.05）。低氧组使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后，低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的蛋白质表达均下调（P<0.05）。结论低氧条件不影响拟胚体的三胚层分化潜力。生理性低氧可以促进悬浮拟胚体的形成和成熟，并且能增强拟胚体的贴壁和贴壁后增殖性能，初步证实通过激活HIF-1α/β-catenin/VEGFA信号通路，提升人诱导多能干细胞的分化能力。

• 小檗碱通过激活 Nrf2-HO-1/GPX4 通路抑制小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡

  黄庆洋, 纪东东, 田绣云, 马琳艳, 孙小锦

  目的 探讨小檗碱对于Erastin诱导小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡的保护作用及其可能机制。方法 以HT22小鼠海马神经元细胞为研究对象，分为对照组、Erastin模型组、Erastin+30 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/L BBR组。采用CCK-8法、特异性 Fe2+ 荧光探针、荧光染料（DAPI）检测和荧光探针（H2DCFH-DA）检测各实验组细胞的增殖情况、活性铁水平、细胞凋亡和活性氧（ROS）变化。 RT-qPCR和Western blot分别检测各实验组细胞的Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA和蛋白表达情况。以60 μmol BBR的最适浓度来进一步探究其作用机制，分为对照组、Erastin模型组、Erastin+60 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/LBBR+2 μmol Nrf2抑制剂 ML385组。通过使用荧光探针和Western blot检测Nrf2抑制剂（ML385）作用后的活性铁的水平、活性氧含量以及Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的表达来验证小檗碱调节的Nrf2-HO-1/GPX4通路对Erastin处理的HT22细胞的保护作用。结果 0.5 μmol/L Erastin作用于HT22细胞8 h，细胞存活率与对照组相比显著被抑制（P<0.05）；同时细胞凋亡、ROS以及活性铁含量增加（P<0.05）。与Erastin组比较，Erastin+30 μmol/L BBR组和Erastin+60 μmol/L BBR组的细胞存活率明显升高（P<0.05），同时显著降低细胞凋亡、ROS以及活性铁含量（P<0.05）。小檗碱增加 HT22细胞中Nrf2、HO-1、GPX4基因及蛋白的 表达量（P<0.05）。加入Nrf2抑制剂ML385后，Nrf2-HO-1/GPX4通路被抑制，并且ROS以及活性铁含量升高（P<0.05）。结论 Erastin诱导HT22细胞发生铁死亡，小檗碱抑制Erastin诱导的铁死亡，可能机制是激活了Nrf2-HO-1/GPX4通路。

• 腺相关病毒衣壳保守区多价抗原肽的原核表达及多克隆抗体制备

  李舒月, 曹春雨, 张 浩, 李玉玲, 张雄洲, 杨子灿, 夏 燕, 王 磊, 吕亚丰

  目的 原核表达和纯化腺相关病毒（AAV）衣壳保守区抗原肽，制备抗AAV衣壳保守区的兔多克隆抗体。方法 设计并合成编码AAV衣壳蛋白保守区的DNA，将序列克隆到载体pET30a，获得质粒pET30a-AAV-CR，原核表达并纯化保守区多价抗原肽，考马斯蓝染色法及Western blot法对AAV保守区多价抗原肽进行鉴定。将日本大耳朵白兔分为实验组与对照组（1只/组），实验组注射AAV保守区蛋白制备多克隆抗体，对照组注射PBS，ELISA检测抗体效价，Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体应用效果。结果 成功构建了表达AAV衣壳保守区抗原肽的质粒pET30a-AAV-CR，表达纯化得到相对分子质量为17000的蛋白质；纯化后的蛋白可在兔体内诱导产生针对AAV衣壳保守区的抗体，且该抗体能广泛性识别AAV1-AAV10衣壳蛋白序列。结论 诱导出AAV衣壳保守区蛋白并成功获得了抗AAV衣壳保守区的多克隆抗体，为后续载体开发以及生物学功能研究奠定了基础。

• 昆明山海棠在中药复方制剂中的定性与定量分析

  吴江杰, 杨 琴, 侯楚祺, 吴馥凌, 王 龙, 刘文钦, 侯连兵

  目的 对中药复方制剂因宁片中的君药昆明山海棠药材进行定性及定量分析。方法 采用薄层色谱（TLC）法对因宁片中昆明山海棠药材进行定性分析并对其分析方法进行优化；采用高效液相色谱（HPLC）法对因宁片中的君药昆明山海棠药材主要成分雷公藤甲素进行定量分析并确定其含量的限量标准。结果 TLC法定性研究表明：因宁片供试品和阳性对照品均在相应色谱位置显色，且分离度好、斑点清晰，阴性无干扰，对不同厂家薄层板、温度、湿度的影响因素考察表明：耐用性良好；HPLC定量分析雷公藤甲素浓度1~100 μg/mL内，以峰面积对雷公藤甲素浓度进行线性拟合，得回归方程A=22.219C-19.165，r=0.9999，线性关系良好；测得3批因宁片试验品雷公藤甲素含量分别为0.34 μg/片、0.34 μg/片、0.28 μg/片，范围0.28~0.34 μg/片，最终确定因宁片中每片含雷公藤甲素含量不得高于0.6 μg。结论 TLC法和HPLC法对中药复方制剂因宁片中昆明山海棠药材进行定性与定量分析研究，该技术稳定、方法简便、准确、系统耐用性良好、专属性强，可为其药材在中药复方制剂中的定性与定量研究提供参考与借鉴。

• 千金藤素抗新冠病毒研究进展

  范华昊, 刘 珂, 洪碧霞, 何诗婷, 韩鹏军, 李卯晨, 王姝琦, 童贻刚

  千金藤素是来自传统中药千金藤的一种生物碱，是双苄基异喹啉生物碱家族的一员，临床中主要用于白细胞减少症等疾病。近来，千金藤素抗新冠病毒的研究受到广泛关注，作为千金藤素抗新冠病毒作用的原创发现者，我们简要总结了千金藤素抗新冠病毒的重要研究进展，包括千金藤素抗新冠病毒活性的发现和验证，千金藤素抗新冠病毒机制研究进展以及临床试验进展。