南方医科大学学报杂志

南方医科大学学报杂志2021年第10期

• 活化的Mir-30a-wnt/β-catenin信号轴通过上调组织蛋白酶K的表达促进牙周膜干细胞向成牙骨质细胞分化

  刘 芬, 周志斐, 薛 洋, 朱 斌, 吴补领, 陈发明

  目的 探讨牙周膜干细胞（PDLSC）成牙骨质向分化过程中mir-30a-wnt/β-catenin信号轴调控组织蛋白酶K（CTSK）表达的功能作用。方法 极限稀释法分离培养PDLSC，釉基质蛋白衍生物（EMD）诱导细胞成牙骨质向分化。在细胞分化过程中，通过microRNA芯片筛选差异表达的microRNA。首先，给予不同分组细胞EMD诱导和/或抑制microRNA表达等处理，无干预组细胞作为对照。利用qPCR和Western blot技术首先验证差异表达的microRNA是否能够调控CTSK的表达。之后，将细胞膜片复合陶瓷支架材料植入裸鼠皮下，利用免疫组织化学方法观察成牙骨质细胞标记蛋白CAP和CEMP-1的表达变化，明确受microRNA 调控的 CTSK 表达变化是否参与了 PDLSC 成牙骨质分化。在此基础上，从蛋白学水平观察wnt信号通路在microRNA调节CTSK表达过程中是否发挥了相应功效。结果 EMD诱导PDLSC成牙骨质向分化过程中，多种microRNA表达发生变化，其中miR-30a表达出现特异性上调（P<0.05）。表达上调的miR-30a进一步调节CTSK的表达（P<0.05），促进PDLSC异位形成类牙骨质样结构，高表达成牙骨质细胞标记蛋白CAP和CEMP-1。抑制wnt/β-catenin信号通路，miR-30a对CTSK的表达调控作用出现相应减弱。结论 EMD可能通过上调miR-30a的表达激活wnt/β-catenin信号通路从而经mir-30a-wnt/β-catenin信号轴调控CTSK诱导PDLSC向成牙骨质细胞方向分化。

• 潜伏表达癌调蛋白的HSV-1减毒载体能有效治疗大鼠机械性视神经损伤

  杨 明, 高瀛政, 李 萌, 曹 霞, 黄新伟

  目的 评价潜伏表达癌调蛋白OCM的HSV-1减毒型载体（1716-OCM）在大鼠机械性视神经损伤中的治疗作用及安全性。方法 体外细胞感染模型中检测重组病毒增殖特性及OCM表达。大鼠按随机数字表法分为3组（对照组、1716-OCM注射组和野生型病毒角膜感染组），每时间点3只/组，于感染后7、14、30、60 d免疫荧光法检测OCM基因及病毒蛋白gB在大鼠视网膜和下丘脑中的表达。大鼠视神经损伤模型中，大鼠按随机数表法分为4组（假手术组，PBS治疗对照组，1716-OCM感染组及1716-OCM感染加cAMP增敏组），5只/组。治疗45 d后，视觉诱发电位（FVEP）检测视觉电生理功能。免疫荧光法检测视网膜RGCs数量及神经髓鞘蛋白表达。结果 重组减毒型1716-OCM在体外细胞感染中病毒增殖远低于野生型病毒，其能够介导OCM有效表达。重组病毒能够介导OCM在大鼠眼部RGC层及脉络膜层表达。相比于野生型病毒，1716-OCM未引发显著的眼部组织结构破坏。在视神经损伤模型中，相比于未治疗组，1716-OCM联合cAMP治疗能够显著促进视网膜RGC存活（P=0.007）并抑制视神经脱髓鞘（P=0.03）。FVEP分析显示1716-OCM联合cAMP显著促进大鼠ΔN1-P1峰振幅恢复（P<0.001）。结论 减毒型重组1716-OCM能够介导OCM在大鼠视网膜表达，玻璃体腔注射1716-OCM重组病毒和cAMP能够有效治疗大鼠机械性视神经损伤。

• 中国女性外周血EMR3基因甲基化水平与乳腺癌的相关性

  周夏婕, 雷水芳, 黎立喜, 徐 天, 顾万建, 马 飞, 杨蓉西

  目的 探究中国人群外周血中C19orf57、MAP9、EMR3、NEK6和PCOLCE2基因的甲基化水平与乳腺癌的相关性。方法 通过病例对照研究收集了258例早期乳腺癌患者和272名健康女性的外周血，并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）定量检测基因上CpG位点的甲基化水平。使用logistics回归模型校正协变量分析DNA甲基化水平与乳腺癌的相关性。Spearman秩相关用于分析基因甲基化水平与年龄的关系。使用非参数检验分析不同临床特征组别的甲基化水平差异。结果 与欧美人群的乳腺癌EMR3高甲基化相反，EMR3基因的低甲基化与中国女性的乳腺癌相关，但该相关性仅存在于≥ 50 岁的女性中（每减少 10%的甲基化，EMR3_CpG_1：OR=1.40；EMR3_CpG_2：OR=2.31；EMR3_CpG_3：OR=2.76，P< 0.05）。EMR3的甲基化水平与肿瘤分期、大小、淋巴转移、ER、PR、HER2、Ki67等没有或仅有弱相关。C19orf57甲基化与乳腺癌无相关性。结论 外周血EMR3基因的低甲基化与中国女性乳腺癌之间存在相关性，尤其是年龄较大或绝经后女性。

• 抑制Notch1/Jagged1通路可促进大鼠骨髓间充质干细胞“归巢”并改善哮喘

  王 坤, 朱慧志, 杨 磊, 徐晴雯, 任冯春, 刘向国

  目的 观察间充质干细胞（BMSCs）归巢调节哮喘Th1/Th“2 漂移”与Notch1/Jagged1通路的关系。方法 20只SD大鼠用随机数字表法均分为4组：正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、BMSCs移植组（BMSCs）、BMSC+Notch抑制剂组。采用卵清蛋白致敏和激发建立哮喘模型，尾静脉注射BMSCs。HE染色观察肺组织病理形态学，酶联免疫吸附法检测肺组织白介素（IL）-5、IL-13、IFN-γ，RT-PCR法检测肺组织Notch1、Jagged1基因表达，免疫荧光染色检测支气管上皮细胞中CXCR4蛋白表达，免疫印迹法检测肺组织T-bet、GATA-3、Notch1、Jagged1蛋白表达。结果 与NC组比较，MC组IFN-γ、T-bet蛋白表达降低，IL-5、IL-13、GATA-3蛋白表达升高，Notch1、Jagged1mRNA和蛋白表达升高（P<0.05或P<0.01）。与MC组比较，BMSCs组、BMSCs+Notch抑制剂组CXCR4、IFN-γ、T-bet蛋白表达量显著升高，BMSCs组Notch1、Jagged1 蛋白表达降低，BMSCs+Notch抑制剂组IL-5、IL-13、Notch1、Jagged1mRNA和蛋白降低（P<0.05或P<0.01）。与BMSCs组比较，BMSCs+Notch抑制剂组CXCR4、IFN-γ表达升高，IL-13、Notch1mRNA表达降低（P<0.05）。结论 BMSCs向哮喘肺组织归巢对Th1/Th2“漂移”产生调节作用，Notch1/Jagged1通路可能参与其过程。

• 苗药验方四大血对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和焦亡的影响

  吴 宁, 袁桃花, 姬进忠, 程 瑶, 李明义, 梁 玺, 孙见飞, 刘 华, 吴昌学

  目的 探讨苗药验方四大血（SX）对人类风湿性关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLSs）凋亡和焦亡的影响。方法 数据库检索RA及凋亡、焦亡相关靶蛋白；韦恩软件分析获得与RA相关凋亡及焦亡蛋白；RA-凋亡-焦亡靶蛋白互作（PPI）网络构建以获取RA中凋亡和焦亡重要靶蛋白；Autodock vina软件进行分子对接验证SX主要活性成分与凋亡和焦亡相关蛋白的结合能力，并通过PyMoL软件进行可视化。人源第2代RA-FLSs MH7A细胞检测SX对MH7A细胞抑制率后分为空白对照组、雷公藤多甘片阳性对照组（TGT组，5 mg/L）及 5、10、20、40 mg/L SX 组，采用 Wound- healing 实验、Transwell 法、ELISA 法及Western blot法分别检测MH7A细胞的迁移和侵袭能力、凋亡和焦亡相关蛋白。结果 获得RA相关凋亡靶蛋白9个、焦亡靶蛋白15个、RA-凋亡-焦亡重叠靶蛋白4个，SX主要活性成分与TNF-α、Fas、Bax等靶蛋白均具有较高亲和力；与空白组相比，给药处理24、48、72 h，随着SX浓度增加，对MH7A细胞抑制率增加（P<0.05），药物作用6、12、24 h，同一时间点内MH7A细胞划痕修复率随SX浓度增加而减少（P<0.05）；药物作用24 h，20、40 mg/L SX组MH7A细胞侵袭个数减少（P<0.05）；20、40 mg/L SX组和TGT组TNF-α、IL-1β、IL-18的表达水平均下降（P<0.05）；20、40 mg/L SX组Bax/Bcl-2比值均增加（P<0.05）；5、40 mg/L SX组Caspase-1表达量均减少（P<0.05）；20、40 mg/L SX组Fas和FasL表达量均增加（P<0.05）。结论 SX可诱导MH7A细胞凋亡、抑制其焦亡，减缓炎症反应，其作用机制可能与下调TNF-α、IL-1β、IL-18细胞因子水平，上调Bax、Fas、FasL，抑制Bcl-2和Caspase-1蛋白表达有关。

• VEGF通过激活ERK/MAPK通路促进三阴性乳腺癌肿瘤干细胞的形成

  王 璐, 赵 琳, 张丽芬, 景 鑫, 张玉姣, 邵 珊, 赵新汉, 罗敏娜

  目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）对三阴性乳腺癌肿瘤干细胞的调控作用并探索其作用机制。方法 通过Oncomine数据库、UALCAN数据库及Human Protein Atlas数据库分别验证VEGF在乳腺癌中的表达情况，分析VEGF表达与不同分子亚型的关系，利用在线数据库分析VEGF的表达情况与乳腺癌预后的关系。选取三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，加入外源性hVEGF165通过体外微球形成实验观察体外成球能力，并利用Western blot、RT-qPCR等方法检测肿瘤干细胞相关标志物CD44、c-Myc、Nanog、ALDH1的表达以及相关通路的激活情况。结果 利用Oncomine、UALCAN、HPA数据库分析显示，VEGF在乳腺癌中表达较癌旁组织增高（P<0.0001），其表达与分子亚型相关，三阴性乳腺癌中VEGF表达显著升高。Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果提示高表达VEGF的乳腺癌患者预后更差，总生存期OS缩短，差异具有统计学意义（P<0.0001）。与VEGF低表达患者相比，VEGF高表达的乳腺癌患者无进展生存期、无远处转移生存期以及复发后生存期均显著缩短，差异具有统计学意义（P<0.0001）。体外实验发现加入外源性的hVEGF165后三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的成球能力显著增强，差异具有统计学意义（P=0.0029）。Western blotting、RT-qPCR结果表明乳腺癌MDA-MB-231微球体中VEGF/NRP-1及肿瘤干细胞相关标志物CD44、Nanog、c-Myc的表达量显著升高。加入外源性的hVEGF165促进了肿瘤干细胞相关标志物CD44、c-Myc、Nanog及ALDH1的表达，而CD24的表达量则显著下降，上述作用具有时间依赖性。Western blotting实验提示加入外源性的hVEGF165能够激活三阴性乳腺癌细胞ERK/MAPK通路。 结论 VEGF可能通过激活ERK/MAPK通路促进了三阴性乳腺癌肿瘤干细胞的形成。

• COPD患者免疫细胞亚群特征及六味补气胶囊干预的分子机制

  王小乐, 朱 洁, 高雅婷, 吴 凡, 杨勤军, 童佳兵, 张星星, 王传博, 吴 迪, 李泽庚

  目的 探讨慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺组织免疫细胞亚群特征及六味补气胶囊改善其免疫炎症失衡的机制。方法 基于基因表达汇编（GEO）数据库，下载COPD相关研究的单细胞测序数据，使用R软件中Seurat包分析获取COPD免疫细胞亚群特征，以构建COPD的各免疫细胞亚群的“免疫细胞亚群-差异基因”关系；通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）平台获取六味补气胶囊的主要活性成分及靶基因，将靶基因映射到COPD各免疫细胞亚群的差异基因，构建“六味补气胶囊-免疫细胞亚群-靶基因”网络，通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，研究该网络中靶基因的显著富集的通路,并获取显著富集通路间关联的靶基因。经六味补气胶囊干预COPD大鼠模型实验研究，分析其对COPD大鼠的肺功能和肺组织病理改变，血清IL1B、NF-κB、TNF-α的表达情况，及肺组织IKBα、JNK、c-JUN、c-FOS的蛋白表达。结果 COPD和正常对照中均存在巨噬细胞、肺泡巨噬细胞等18种免疫相关细胞亚群。与正常对照相比，COPD患者肺组织中巨噬细胞、cDC1、pDC、肥大细胞、T细胞、成熟树突状细胞占总细胞数比的差异均具有统计学意义（P<0.05）。六味补气胶囊靶向多个免疫细胞亚群，且靶基因主要富集于脂质和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、Toll样受体信号通路、TNF 信号通路等免疫炎症相关信号通路，其中CXCL8、IL1B、JUN、NFKBIA、MAPK8、FOS等可能是显著富集通路间的关联基因，动物实验研究表明六味补气胶囊可有效改善COPD大鼠肺功能和肺组织病理改变，并降低COPD大鼠血清IL1B、TNF-α、NF-κB（P<0.05）和肺组织肺组织JNK、c-JUN、c-FOS（P<0.01）蛋白的表达，升高肺组织IκBα蛋白表达（P<0.01）。结论 六味补气胶囊可能通过靶向COPD患者肺组织中多种免疫细胞亚群发挥免疫调节作用。

• 基于光学相干断层扫描的不同类型糖尿病性黄斑水肿对康柏西普的治疗反应

  张 怡, 姚 静, 权彦龙, 王建明, 邢 瑶, 周爱意

  目的 观察基于光学相干断层扫描（OCT）的不同类型糖尿病性黄斑水肿（DME）对康柏西普的治疗反应，并分析可能影响治疗反应和效果的因素。方法 回顾性分析2019年2月~2021年2月于我院确诊为DME且按照1+PRN方案行玻璃体腔注射康柏西普治疗的患者65例76只眼的临床资料。根据OCT特征将其分为3种类型：囊样黄斑水肿（CME）28只眼，浆液性视网膜脱离（SRD）33只眼和弥漫性视网膜增厚（DRT）15只眼。观察并比较治疗前及首次治疗后3月时各组患眼最佳矫正视力（BCVA）、黄斑中心视网膜厚度（CRT）；比较不同类型DME的基线OCT特征并分析其与康柏西普治疗反应及效果的关系。结果 3种类型DME治疗后3月BCVA均较基线明显好转（P<0.05）。3种类型DME 治疗后3月CRT均明显低于基线（P<0.05）。基线视网膜外层高反射点（HF）数量、椭圆体带（EZ）中断比例在SRD组中最高（P<0.05）。基线视网膜外层HF与基线CRT、CRT改变量、治疗后CRT均相关（P<0.05）。基线外界膜（ELM）/EZ中断组较连续组基线视力更差、基线CRT更高，治疗后3月CRT改变量更大、BCVA更差（P<0.05）。结论 3种类型DME在接受玻璃体腔注射康柏西普治疗后，功能学指标BCVA和形态学指标CRT均得到明显改善，其中，SRD类型对康柏西普治疗的形态学反应最好，DRT类型的形态学反应相对较差。更多的基线外层HF可能预示着更好的形态学治疗反应。基线ELM/EZ中断则提示治疗后3月视力预后更差。

• CDK1、CCNB1和NDC80与乙型肝炎相关肝细胞癌的预后和进展相关：基于生物信息学方法

  李玉杰, 吴登强, 韦常宏, 杨雪佳, 周素芳

  目的 探讨 HBV 转化为 HCC 相关的关键基因，并探索相关的分子机制。方法 分析基因表达综合（GEO）数据库中GSE55092、GSE84044和GSE121248的mRNA微阵列数据，其中包括119个HBV相关的HCC组织和252个HBV相关的非肿瘤组织。“sva”R包用于去除批间差。进行整合分析，获取HBV相关肝癌和HBV组织中的差异表达基因（DEGs），通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析对差异表达基因进行功能注释。使用相互作用基因搜索工具（STRING）构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，挖掘最重要的模块和关键基因。cBioportal用于分析hub基因的相关性。利用Kaplan-Meier和Oncomine数据库对TCGA数据库中肝癌基因表达数据进行验证，探讨hub基因与肝癌发生、发展和预后的关系。通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）实验验证17对临床肝细胞癌样本与邻近非肿瘤组织中hub基因的表达。结果 共获得121个DEGs（P< 0.01），鉴定出3个遗传标记，细胞周期素依赖性激酶1（CDK1）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）和核分裂周期蛋白80（NDC80），与细胞周期、嘧啶代谢和DNA复制有关，这3个基因高度相关（P<0.05）。UALCAN数据库证实这些基因在肝癌组织中高表达并获得相关预后信息。Kaplan-Meier表明，它们与HCC患者的低存活率相关。CDK1、CCNB1和NDC80与肝癌分级相关（P< 0.05），RT-qPCR实验证实CDK1、CCNB1和NDC80的mRNA在肝细胞癌中的表达明显高于癌旁组织。结论 CDK1、CCNB1 和NDC80基因可作为HBV相关肝细胞癌的预后标志物，在肝癌的基础研究和临床治疗方面有一定的应用价值。

• 氧化苦参碱通过抑制CHK1/2磷酸化改善糖尿病大鼠肾组织的纤维化和炎症

  李志阳, 梁 丹, 肖雅文, 代云莉, 艾福军, 丁 菁, 石明隽, 肖 瑛, 郭 兵

  目的 探讨氧化苦参碱（OMT）抗炎抗纤维化是否是通过影响细胞周期检测点激酶1/2（CHK1/2）来发挥。方法 SD大鼠采用完全随机设计分为正常对照组（NC）、糖尿病模型组（DM）和氧化苦参碱治疗组（OMT），6只/组，尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）（55 mg/kg）复制糖尿病模型。HE、Masson染色观察病理组织形态学变化；免疫组织化学染色观察CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2的表达部位；ELISA检测肾组织上清中IL-6和IL-1β的含量；Western blot检测CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、 Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）蛋白的表达水平；NRK-52E细胞按处理方式分为正常糖对照组（NG组）、高糖模型组（HG组）、正常糖用药组（NG+OMT组）、高糖用药组（HG+OMT组）、正常糖空载组（NG+con组）、正常糖敲低组（NG+siCHK1/2）、高糖空载组（HG+con组）、高糖敲低组（HG+siCHK1/2），Western blot检测CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白的表达水平。结果 OMT可降低大鼠血糖、血肌酐和24 h尿蛋白（P<0.05）；DM组大鼠肾脏已出现炎性细胞浸润和纤维化表型，OMT组有所改善；OMT有明显抗炎作用（P<0.05）；CHK1/2主要表达在肾小管胞浆及胞核，DM组CHK1/2磷酸化水平高于NC组、OMT组；大鼠肾组织和NRK-52E细胞中经OMT治疗后p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白表达含量均明显下降（P<0.05）；敲低CHK1/2后p-CHK1/2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白表达均明显下降（P<0.05）。结论 OMT在糖尿病大鼠肾脏中发挥抗炎、抗纤维化的作用机制可能是通过影响CHK1、CHK2的表达从而影响其磷酸化水平，减少下游炎症介质的释放，减轻细胞外基质的分泌和沉积。

• 痰瘀同治法对糖尿病大鼠心肌微血管病变AGEs/RAGE轴及氧化应激的影响

  许笑雯, 储全根, 储 俊, 蔡正银, 轩 云, 罗宝璐, 李 帅, 陈 静, 罗世旷, 王悦琦

  目的 观察痰瘀同治对高糖诱导心肌微血管内皮细胞损伤的保护作用并从AGEs/RAGE轴探讨其作用机制。方法 利用酶消化法从大鼠心脏中分离出原代心肌微血管内皮细胞（CMECs），经免疫荧光法鉴定后，培养传代备用。在不同时间段采用不同浓度的葡萄糖对大鼠CMECs进行诱导干预，MTT检测方法发现葡萄糖浓度在33 mmol/L且干预48 h为最佳造模条件；予不同浓度的含药血清，同上法检测得10%含药血清干预48 h为最佳干预方法。将造模成功的CMECs分成5组：模型组（MC）、化痰组（RP）、化瘀组（DBS）、痰瘀同治组（RPDBS）、ALT-711组，予以10%含药血清和ALT-711细胞干预制剂进行干预；另设一组空白对照组（NC）。采用ELISA法检测各组内皮细胞AGEs含量；免疫荧光法、Western blot法和RT-qPCR法检测各组内皮细胞RAGE蛋白及基因表达水平；细胞色素c还原法检测各组内皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性水平；二氢乙锭荧光探针法检测各组内皮细胞活性氧自由基（ROS）活性水平。结果 MC组较NC组，细胞内晚期糖基化终末产物（AGEs）含量、RAGE蛋白及基因表达水平、NADPH氧化酶活性水平和ROS活性水平均升高（P<0.01）。与MC组比较，各治疗组的上述指标均降低（P<0.01）。在降低AGEs含量、RAGE蛋白及基因表达水平和NADPH氧化酶活性水平上，RPDBS组较RP组与DBS组显著下降（P<0.01，P0.05），较RP组显著下降（P<0.01）。结论 痰瘀同治法可能通过抑制AGEs/RAGE轴及氧化应激对高糖损伤的CMECs起到保护作用，从而防治糖尿病心肌微血管病变，且痰瘀同治法优于单独化痰法和单独化瘀法。

• RIP1/RIP3-MLKL信号通路与慢性心力衰竭的发生、发展及预后相关

  陈永锋, 李小荣, 赖薇薇, 朱飞宇, 谭 鑫, 鲜 维, 康品方, 王洪巨

  目的 通过检测正常人与慢性心力衰竭（HF）患者血浆中受体相互作用的蛋白激酶RIP1、RIP3和混合谱系激酶结构域样蛋白MLKL的表达水平，探讨程序性坏死信号通路RIP1/RIP3-MLKL在HF过程中的表达规律及临床意义。方法 入选2020年2 月~2020年10月在我院接受治疗的慢性HF患者（NYHA Ⅱ~Ⅳ级）。正常对照组（n=21），Ⅱ级（n=20），Ⅲ级（n=33），Ⅳ级（n=43）。采集所有患者的空腹静脉血，ELISA法和Western blotting分别检测RIP1/RIP3-MLKL表达水平和通路蛋白表达情况，同时对心功能Ⅳ级患者进行为期5个月的临床随访，评估临床预后指标。结果 与正常对照组相比，心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量均增加（P<0.01）；与II级组相比，心功能Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量均增加（P<0.01）；与Ⅲ级组相比，心功能Ⅳ级组RIP1、MLKL表达量增加（P<0.05）。WB检测RIP1/RIP3-MLKL通路中各蛋白表达量，均存在上调趋势。经pearson相关性分析，HF患者RIP1/RIP3-MLKL表达量与Scr、AST、LVEDD、NT-ProBNP呈正相关（r=0.375、0.231、0.238、0.339、 0.299、0.373、0.228、0.256、0.253、0.184、0.189、0.187，P<0.05），与LVEF呈负相关（r=-0.268、-0.234、-0.322，P<0.05）。此外对临床随访结果运用独立样本t检验分析，发现在心功能Ⅳ级患者中RIP1/RIP3-MLKL表达量更高组临床预后指标更差。结论 RIP1-RIP3-MLKL信号通路在HF患者中表达明显增加，与HF严重程度呈正相关；慢性HF的发生、发展及预后可能与RIP1/RIP3-MLKL信号通路的激活与表达有关。

• 不同相对分子质量的黑根霉胞外多糖的生物活性

  李 璋, 许 晅, 孟 迎, 马群飞, Huma Farooque Hashmi, 张鹏英, 陈靠山

  目的 探讨不同相对分子质量黑根霉胞外多糖的抗氧化、抗肿瘤和免疫调节活性。方法 通过分级醇沉从黑根霉的发酵液中分离得到3种不同相对分子质量的多糖，分别命名为RPS-1，RPS-2和RPS-3，检测3种多糖对DPPH、ABTS和羟自由基的清除活性。体外培养小鼠前胃癌细胞MFC、人非小细胞肺癌细胞A549和小鼠巨噬细胞RAW 264.7，给药48 h或24h后CCK-8法检测各组细胞存活率，一氧化氮试剂盒检测RAW 264.7细胞上清液中的NO水平，流式细胞仪检测3种多糖对A549细胞凋亡率的影响。结果 RPS-1，RPS-2和RPS-3均具有较好的抗氧化活性，中等相对分子质量多糖RPS-1对DPPH和ABTS自由基的清除活性显著高于RPS-2和RPS-3（P<0.05），低相对分子质量多糖RPS-3对羟自由基的清除活性显著高于RPS-1和RPS-2（P0.05），RPS-2处理后A549细胞的凋亡率显著高于RPS-1和RPS-3（P<0.05）。高相对分子质量多糖RPS-2促进RAW 264.7细胞增殖的活性显著高于RPS-1和RPS-3（P<0.05），RPS-2处理后的RAW 264.7细胞释放的NO含量显著高于RPS-1和RPS-3（P<0.01）。结论 3种不同相对分子质量的多糖均具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节活性，低、中相对分子质量多糖RPS-1和RPS-3具有较好的抗氧化活性，高相对分子质量多糖RPS-2具有较好的抗肿瘤和免疫调节活性。

• Mage-D1与活化后的p75神经营养因子受体结合可正向调节大鼠外胚间充质干细胞的矿化

  罗玉婷, 杨正艳, 李 蒙, 赵曼竹, 温秀杰, 周 智

  目的 检测Mage-D1与活化后p75NTR的结合及对外胚间充质干细胞（EMSCs）矿化的调控。方法 取孕19.5 d SD大鼠牙胚，组织贴壁法获取EMSCs，流式细胞术检测细胞表面抗原。设置实验分组：空白对照组（NC），100 ng/mL NGF刺激组（100 ng/mL NGF）、慢病毒干扰Mage-D1组（SH-Mage-D1）。邻位连接技术检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR结合的变化，并比较不同分组间的结合强度差异。茜素红与ALP染色观察染色，RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1的表达水平。结果 组织块贴壁法获得孕19.5 dEMSCs，流式细胞术检测细胞表面抗原结果为CD44、CD90、CD29、CD146，CD105高表达，CD45低表达；邻位连接法检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR的结合随着时间的延长而增多，且实验组与对照组相比结合强度差异具有统计学意义（P<0.05）；茜素红与ALP染色结果显示矿化结节与碱性磷酸酶与强度变化一致；RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1在100 ng/mL NGF组最高（P<0.05）。结论 Mage-D1在外胚层间充质细胞中可与经NGF活化后的p75NTR直接结合，且二者的结合对EMSCs的矿化有正向调节作用。

• 白杨素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗炎和抗氧化作用：基于蛋白质芯片方法

  蔡苏娜, 李 强, 周 慧, 许雨墨, 宋 静, 甘 超, 戚之琳, 齐世美

  目的 探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在白杨素抗炎抗氧化作用中的机制。方法 分别用0、5、10、15、30、60、120、240 μg/mL白杨素处理RAW264.7细胞24 h后，CCK-8法检测细胞活力。用白杨素预处理细胞2 h，加入脂多糖（100 ng/mL）分别刺激0、10、30 min，1、2、4、8、16 h，运用蛋白质芯片进行相关信号分子的筛选。用白杨素（10、30、60 μg/mL）孵育细胞2 h后，加入脂多糖刺激18 h，ELISA法检测IL-6，MCP-1和TNF-α的释放量；Griess法检测NO浓度；DCFH-DA荧光探针法检测ROS水平。设立空白对照组，白杨素（60 μg/mL）单独处理组，脂多糖（100 ng/mL）单独刺激组，以及白杨素和脂多糖联合处理组，RT-PCR法检测iNOS和COX-2的mRNA的表达量。分别用脂多糖（100 ng/mL），N-乙酰-半胱氨酸（NAC）（20 μmol/L）或白杨素（10、30、60 μg/mL）单独或共处理细胞后，用Western blot检测炎症相关通路p-AKT、p-PRAS40、p-mTOR、mTOR、p-P70S6k、p-S6RP、 S6RP的表达水平。结果 白杨素剂量在60 μg/mL内，对细胞活力基本无影响（P>0.05）；白杨素能够降低脂多糖刺激诱导的IL-6，MCP-1，TNF-α和炎症介质NO的释放量（P<0.01），抑制iNOS和COX-2的蛋白表达量和mRNA的表达水平（P<0.01）；蛋白质芯片筛选结果提示，脂多糖能够激活AKT/mTOR信号通路，而白杨素抑制其信号分子的活化，Western blot结果进一步验证了蛋白质芯片的结果（P<0.01）；白杨素显著下调内源性ROS的生成；运用NAC清除细胞内ROS后，炎症蛋白iNOS和COX-2的表达量下调（P<0.05），而AKT/mTOR通路的活化被阻断（P<0.05）。结论 白杨素通过抑制上游信号分子ROS的合成，进而抑制AKT/mTOR信号通路的活化，调控核糖体的翻译过程，下调促炎细胞因子和炎症介质的合成和释放，发挥抗炎作用。

• MiR-671-5p通过负向调控SMAD3抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

  胡雅琼, 梁 答, 陈新璐, 陈 琳, 白 俊, 李洪利, 尹崇高, 钟 伟

  目的 探讨miR-671-5p影响骨肉瘤的迁移侵袭的相关机制。方法 通过NCBI在线数据库筛选骨肉瘤中差异表达的微小RNA（miRNA）、预测miRNA的靶蛋白并进行功能分析；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）用于检测转染过表达miR-671-5p质粒后con组和miR-671-5p组骨肉瘤细胞中miR-671-5p的表达情况；通过Transwell实验检测转染质粒后骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力；Western blot实验检测相关蛋白在骨肉瘤细胞中的表达情况；荧光素酶报告基因检测重组人SMAD家族成员3（SMAD3）的 3’UTR中是否含有miR-671-5p的结合位点。结果 MiR-671-5p在骨肉瘤组织和细胞中表达下调（P<0.05）。qRT-PCR证明转染过表达miR-671-5p质粒后，细胞转染成功（P<0.05）。过表达骨肉瘤细胞中的miR-671-5p后细胞的迁移和侵袭能力明显降低（P<0.05），并且miR-671-5p能够抑制骨肉瘤细胞的上皮间质转化（EMT）（P<0.05）；Western blot结果显示SMAD3在骨肉瘤细胞中表达上调（P<0.05）；荧光素酶报告基因检测证实miR-671-5p与SMAD3的3’UTR之间存在结合位点（P<0.05）；Western blot结果显示转染过表达SMAD3质粒后，SMAD3表达明显升高（P<0.05），而miR-671-5p能明显抑制SMAD3的表达（P< 0.05）；Transwell实验证明SMAD3能够促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05），而miR-671-5p则能够逆转这种促进作用（P<0.05）。结论 MiR-671-5p能够通过负向调控SMAD3抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力。

• CT影像组学鉴别儿童腹膜后神经母细胞瘤和节细胞神经母细胞瘤的价值

  王浩入, 陈 欣, 刘 欢, 余春霖, 何 玲

  目的 基于平扫和增强CT的影像组学分析在鉴别儿童腹膜后神经母细胞瘤（NB）和节细胞性神经母细胞瘤（GNB）中的价值。方法 纳入172例NB和48例GNB患儿，按7∶3的比例分层随机抽样划分为训练集和测试集。分别从平扫期、动脉期和静脉期CT图像中提取并筛选影像组学特征，基于最优特征子集采用多变量回归模型建立各期以及三期复合的影像组学模型，绘制模型ROC曲线，计算并比较各期模型的AUC、准确度、灵敏度及特异性等评价指标。结果 从平扫期、动脉期和静脉期CT图像中分别提取了1218个影像组学特征，最终筛选出平扫期模型4个特征、动脉期模型3个特征、静脉期模型2个特征以及三期复合模型 5 个特征。平扫期模型在训练集中的 AUC 为 0.840（95%CI: 0.778~0.902），测试集中 AUC 为 0.804（95%CI: 0.699~ 0.899）。动脉期模型在训练集中的AUC为0.819（95%CI: 0.759~0.877），测试集中AUC为0.815（95%CI: 0.697~0.915）。静脉期模型在训练集中的AUC为0.730（95%CI: 0.649~0.803），测试集中AUC为0.751（95%CI: 0.619~0.869）。三期复合模型在训练集中的AUC为0.861（95%CI: 0.809~0.910），测试集中AUC为0.827（95%CI: 0.726~0.915）。结论 基于平扫和增强CT的影像组学特征有助于区分儿童腹膜后NB和GNB，纹理特征相对于一阶直方图特征能更好的反映病灶的差异。平扫期、动脉期和静脉期影像组学模型均可较好鉴别儿童腹膜后NB和GNB。三期复合模型与平扫期、动脉期模型效能相似，但优于静脉期模型。

• 99mTc-MIBI SPECT/CT显像结合半定量分析在甲状旁腺功能亢进症中的诊断价值及影响因素

  郑玉婷, 池晓华, 齐永帅, 江 英, 黄 凯, 何 云, 王思飞, 李贵平

  目的 评估99mTc-MIBI SPECT/CT、99mTc-MIBI双时相显像（DPS）及颈部超声（US）3种检查方式在甲状旁腺功能亢进症（HPT）患者术前定位中的诊断效能并进一步探讨SPECT/CT半定量分析影响因素。方法 回顾性分析2015年1月~2019年7月行手术治疗的104例HPT患者，术前行99mTc-MIBI显像104例和超声82例。利用半定量分析技术勾画感兴趣区并计算病灶/同侧三角肌摄取比值（T/NT）。采用卡方检验分析99mTc-MIBI SPECT/CT、99mTc-MIBI DPS、US 3种检查方式诊断HPT患者的灵敏度及采用非参数检验进行三种方式检出效能分析。使用Spearman对甲状旁腺瘤（PA）、甲状旁腺增生（PH）的T/NT比值与Cox-2、Bcl-2表达水平进行相关性分析。结果 99mTc-MIBI SPECT/CT、99mTc-MIBI DPS、US检查的诊断灵敏度依次为95.19%（99/104）、91.3%（95/104）、81.71%（67/82）；其中99mTc-MIBI SPECT/CT与US相比具有统计学意义（χ2=9.59，P=0.008）。3种检查方式对PH诊断灵敏度依次为 99mTc-MIBI SPECT/CT>99mTc-MIBI DPS>US（P 均 0.05）。含脂肪的增生腺体T/NT比值小于无脂肪的增生腺体（P=0.009）。Bcl-2在PA假阴性组病灶表达低于真阳性组（P= 0.046），而Cox-2在两组病灶中的表达无显著差异（P>0.05）；Bcl-2和Cox-2在PH两组病灶中的表达差异均无统计学意义（P> 0.05）。结论 99mTc-MIBI SPECT/CT对HPT定位诊断具有较高的灵敏度，病灶的T/NT比值与体积呈正相关，PA病灶的Bcl-2表达增高、PH病灶的细胞脂肪含量减少有利于HPT病灶腺体的检出。

• 磁共振成像DWI序列可代替增强扫描评估高强度聚焦超声治疗子宫腺肌症的即时消融效果

  崔运能, 姚亮凤, 冯敏清, 张 婧, 张大伟

  目的 探讨磁共振成像DWI序列在评估高强度聚焦超声（HIFU）治疗子宫腺肌症即时消融效果中代替增强扫描的可行性。方法 回顾性分析2017年12月~2020年7月在南方医科大学附属佛山妇幼保健院就诊的29例子宫腺肌症患者资料，平均年龄40.5±5.4岁，均于HIFU术前及术后24 h内行MRI检查。由两名观察者独立评估DWI图像上消融灶的形态，分为1型：斑点状或无信号改变，2型：斑片状，3型：环状，通过kappa检验法评估DWI图像上消融灶形态分型的观察者间、观察者内一致性。 在DWI图像上测量2型及3型消融灶的消融坏死区体积，通过Bland-Altman法评估DWI与增强扫描图像上测量消融坏死区体积的一致性、DWI图像上测量消融坏死区体积的观察者间、观察者内的可靠性。结果 29个消融坏死区，体积为36.9（16.4，65.6）cm3, 在DWI上24~25个（82.8%~86.2%）消融灶为可测量的2、3型。在DWI图像，消融灶形态分型的观察者间及观察者内一致性的kappa值分别为0.798（P=0.000）、0.933（P=0.000）。Bland-Altman图显示，DWI与增强扫描图像上测量消融坏死区体积的一致性、DWI图像上测量消融坏死区体积的观察者间、观察者内的可靠性均为良好，均仅有一个点在95%一致性界限范围之外。4~5个无法在DWI图像上测量的1型消融灶的体积较小，最大者仅为18.61 cm3，消融治疗效果欠佳。结论 通过对消融坏死区形态评估、体积测量，DWI序列可评估子宫肌腺症HIFU治疗的即时消融效果，代替增强扫描。

• 调控Smo活性对成年大鼠神经干细胞增殖和迁移的影响

  仇欣霞, 陈 荷, 冯德龙, 董为人

  目的 探讨Shh信号通路中G蛋白偶联受体Smoothened（Smo）对成年大鼠神经干细胞（ANSCs）增殖、迁移的影响并阐明其作用机制。方法 培养ANSCs，分别添加Smo的激动剂Purmorphamine及其抑制剂Cyclopamine，细胞增殖-毒性实验（CCK8）检测其对ANSCs增殖的影响；细胞划痕实验检测其对ANSCs迁移能力的影响；实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Sonic Hedgehog（Shh）信号通路的细胞表面Patched蛋白（Ptch1）、G蛋白偶联受体Smo、转录因子（Gli1）以及神经导向因子（Slit1）和脑源性神经营养因子（BDNF）表达量的变化。结果 Smo激动剂PM对ANSCs的增殖有明显促进作用，48 h后PM组ANSCs的吸光度明显升高（P<0.01）；PM可以促进ANSCs的迁移，48 h后的PM组ANSCs划痕面积显著减小（P<0.01）；Smo抑制剂CPM对ANSCs的增殖和迁移均有显著的抑制作用；RT-PCR实验显示PM组细胞中的Ptch1、Smo、Gli1及Slit1、BDNF表达水平均明显增加（P<0.05）。结论 调控Smo的活性可以促进或抑制成年神经干细胞的增殖和迁移，其作用机制可能与调节BDNF和Slit1的表达有关。