南方医科大学学报杂志

南方医科大学学报杂志2022年第9期

• CD40LG是与浸润性乳腺癌肿瘤微环境中免疫和基质相关的预后标志物

  郭 丽, 马银玲, 李 婷, 李金平

  目的 旨在寻找与浸润性乳腺癌（BRCA）发生相关的肿瘤微环境（TME）相关基因，以预测其预后并为临床提供治疗靶点。方法 从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中检索到RNA转录组数据和临床相关数据。利用ESTIMATE 算法计算基质评分和免疫评分。然后通过取交集筛选出差异表达基因（DEGs）。利用蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和单变量COX回归分析来确定DEGs中的核心基因。选取一个核心基因进行GSEA集富集分析和CIBERSORT分析，以分别区分核心基因表达的功能和肿瘤浸润免疫细胞（TICs）的比例。最终用Western blot和qRT-PCR对CD40LG的表达水平进行临床验证。结果 从TCGA中提取了1222个样本（124个正常样本和1098个肿瘤样本）进行分析，共获得了487个DEG。这些基因主要富集在与免疫相关的途径中。进一步的交叉分析揭示了11个关键基因，包括 CD40LG、ITK、CD5、CD3E、SPN、IL7R、CD48、CCL19、CD2、CD52和CD2711，这些基因被证明与乳腺癌TME状态相关。挑选了CD40LG进行进一步研究，结果表明，CD40LG高表达BRCA患者的总生存期（OS）比低表达BRCA患者更长（P=0.002），并且CD40LG表达在TNM 分期、肿瘤大小方面的差异也具有统计学意义（P<0.05）。GSEA 和 CIBERSORT 分析表明CD40LG的表达与TME中的免疫活性有关。Western blot和qRT-PCR结果显示CD40LG在乳腺癌细胞及癌组织中的蛋白及mRNA表达量均低于乳腺正常细胞及癌旁组织（P<0.05）。结论 CD40LG在TME中高表达与BRCA患者的生存呈正相关，所以CD40LG可能是一种新的用于预后预测的生物标志物。其生物学行为可能促进我们对肿瘤进展的分子机制和靶向治疗的理解。

• TRAF6通过内源性凋亡通路促进卡介苗诱导的巨噬细胞凋亡

  马沁梅, 刘 莉, 于嘉霖, 宫照乾, 王晓平, 吴晓玲, 邓光存

  目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）对卡介苗（BCG）诱导巨噬细胞凋亡的调控作用。方法 Q-PCR检测活动性结核患者外周血中TRAF6的表达后利用不同感染复数的BCG感染RAW264.7细胞，在感染的不同时间通过Q-PCR和Western blot检测巨噬细胞中Caspase 3和TRAF6的表达。时间梯度试验处理组分为5组：对照组（未感染，C）、BCG感染6 h组、12 h组、18 h组和24 h组；感染复数试验处理组分为5组：对照组（未感染，C）、5 MOI组、10 MOI组、15 MOI组和20 MOI组。随后，通过小干扰RNA技术敲减RAW264.7细胞中TRAF6的表达，并结合BCG感染建立TRAF6敲减模型。TRAF6敲减实验分为4组：阴性对照组（NC）、BCG单独感染组（BCG）、TRAF6小干扰RNA单独处理组（siRNA）和TRAF6小干扰RNA与BCG共处理组（siRNA+BCG）。利用平板涂布法检测巨噬细胞菌载量变化。通过流式细胞术检测巨噬细胞凋亡率和线粒体膜电位变化。利用Western blot检测TRAF6、Caspase 3、PARP、Bcl-2，BAX的表达。使用免疫荧光技术检测TRAF6与Caspase 3的表达。结果与健康人群相比，活动性结核患者外周血中TRAF6高表达（P<0.001）。BCG感染显著上调RAW264.7中TRAF6与Caspase 3的表达，且当感染时间为18 h（P=0.03，P=0.04），感染复数为15时二者表达量最高（P<0.001，P<0.001）。敲减TRAF6上调BCG感染的巨噬细胞内的菌载量（P=0.05）。与BCG单独处理组相比，敲减TRAF6显著抑制BCG感染的巨噬细胞凋亡率（P<0.001），并显著下调Caspase 3（P=0.002）和PARP的表达（P<0.001）。同时，BCG感染RAW264.7细胞的线粒体膜电位上升（P<0.001），而敲减TRAF6抑制BCG感染的巨噬细胞线粒体膜电位（P<0.001）。敲减TRAF6显著下调BCG感染巨噬细胞中BAX表达（P=0.005）的同时上调Bcl-2的表达（P=0.04）。结论 TRAF6通过内源性凋亡通路促进BCG感染的巨噬细胞凋亡。

• DNAM-1通过IL-2/STAT-5通路调节Ⅰ型调节性T细胞的增殖和功能

  王 宁, 王一晗, 姜朋涛, 吕明华, 胡志芳, 徐 曦

  目的 探讨DNAM-1对Ⅰ型调节性T细胞（Tr1细胞）活化、增殖和功能的影响及相关分子机制。方法 利用anti-CD3/CD28激活小鼠T细胞，采用流式细胞术分别检测静息和激活状态下CD4+ T细胞和Tr1细胞DNAM-1分子表达变化；分离DNAM-1基因敲除小鼠（KO小鼠）脾脏初始CD4+ T细胞并体外诱导Tr1细胞，流式细胞术检测CD25和CD69活化分子表达水平，CFSE标记后检测增殖能力，IL-2刺激前后检测KO小鼠 Tr1细胞分泌IL-10和转录激活蛋白（p-STAT5）水平变化。结果 流式细胞术结果显示：与静息状态下相比较，激活状态的CD4+ T细胞和Tr1细胞表达DNAM-1分子均增高（P<0.05）；敲除DNAM-1不影响小鼠脾脏Tr1细胞的数量和比例，但KO小鼠Tr1细胞表达细胞激活分子CD25和CD69均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与WT小鼠比较，KO小鼠诱导型Tr1细胞体外增殖能力降低（P<0.05）；与WT组Tr1细胞比较，KO小鼠Tr1细胞分泌抑制性细胞因子IL-10水平降低（P<0.05），给予IL-2刺激后仍无法逆转，表达Il-10 mRNA和Gzmb mRNA水平降低（P<0.05）；给予不同剂量IL-2刺激Tr1细胞后，KO小鼠Tr1细胞表达p-STAT5水平相比较WT组均降低（P<0.05）。结论 DNAM-1参与Tr1细胞的活化和增殖，并通过IL-2/STAT5信号通路影响Tr1细胞抑制功能。

• PCGF1在直肠腺癌中高表达，沉默后可抑制直肠腺癌的增殖

  曾银珍, 樊 嵘

  目的 探讨PCGF1在直肠腺癌中的表达及增殖的调控作用。方法 采用UALCAN和ENCORI数据库在线分析PCGF1在直肠腺癌组织和正常组织中的表达丰度，以及与直肠腺癌临床病理参数以及生存预后的相关性。通过qPCR和Western blot方法检测直肠腺癌细胞株和正常细胞株PCGF1表达水平。采用慢病毒载体分别构建PCGF1过表达和沉默稳定转染细胞系，将细胞分为未转染、过表达和沉默组，通过CCK-8法检测细胞增殖能力。裸鼠成瘤实验检测PCGF1对体内肿瘤增殖的影响。结果PCGF1在直肠腺癌组织中呈现高表达（P<0.001），PCGF1表达与直肠腺癌分期、组织分化及淋巴结是否转移有关（P<0.001），且PCGF1高表达的直肠腺癌患者预后更差（P<0.05）。SW837和SW1463细胞中PCGF1沉默组细胞增殖能力降低（P<0.05），且PCGF1沉默明显抑制直肠癌细胞在裸鼠体内的增殖（P<0.01）。结论 PCGF1在直肠腺癌组织中高表达，可能是直肠腺癌患者生存及预后的标志分子和潜在治疗靶标。

• MiRNA-26a通过调控结缔组织生长因子缓解血管平滑肌细胞的钙化

  吴 伟, 程 龙, 王 杰, 杨传蕾, 尚玉强

  目的 探究miRNA-26a调控结缔组织生长因子对血管平滑肌细胞钙化的作用。方法 将细胞分为对照组、模型组、模型+AR234960组、AR234960+miR-26a mimic组和miR-26a mimic组。对照组细胞正常培养基培养，模型组VSMC细胞诱导钙化，模型+AR234960组的VSMC细胞诱导钙化后加入AR234960激动剂干预，AR234960+miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后用AR234960激动剂和miR-26a mimic处理，miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后转染miR-26a mimic。茜素红染色测定各组细胞钙化沉积；试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性；荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen II基因和蛋白表达情况。双荧光素酶基因验证miR-26a与CTGF的结合。结果 平滑肌A7r5细胞钙化后，miR-26a的表达随着钙化时间的增加而降低（P<0.05），而CTGF的表达随钙化时间的增加而增加（P<0.05）。茜素红染色结果显示，AR234960能够增加细胞的钙化程度，而miR-26a mimic能够减轻细胞钙化。与对照组相比，模型组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著升高（P<0.05），OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（P0.05），而miR-26a mimic组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著降低（P<0.05），OPG mRNA和蛋白的表达显著升高（P<0.05）；与miR-26a mimic组相比，AR234960+miR-26amimic组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著升高（P<0.05），OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（P<0.05）。双荧光素酶基因检测结果显示，miR-26a-inhibitor组CTGF 3'-UTR野生型中相对荧光素酶活性较miR-26a-mimic组显著升高（P<0.05）。结论 miRNA-26a能够有效降低细胞中ALP活性及OPN、BMP-2、Collagen II的表达，同时增加钙化细胞中OPG水平，为miRNA-26a通过调控CTGF水平进而对缓解血管平滑肌细胞钙化提供了理论依据。

• 基于非局部低秩稀疏矩阵分解的低剂量脑灌注CT图像恢复方法

  牛善洲, 刘 宏, 刘沛沄, 张梦真, 李 硕, 梁礼境, 李 楠, 刘国良

  目的 为了减少脑灌注CT检查的辐射剂量，提高低剂量脑灌注CT图像质量，本文提出一种基于非局部低秩稀疏矩阵分解的低剂量脑灌注CT图像恢复方法。方法 对低剂量脑灌注CT图像进行分块形成一个矩阵，构建低秩稀疏矩阵分解模型进行求解后得到优质的低剂量脑灌注CT图像，最后利用恢复后的脑灌注CT序列图像计算出脑血流动力学参数图像。结果 在数值实验中，滤波反投影算法的图像的平均结构相似性为0.9438，本文方法恢复结果的平均结构相似性提高到0.9765；滤波反投影算法得到的脑血流量和脑血容量参数图像的结构相似性分别为0.7005和0.6856，本文方法得到的脑血流量和脑血容量参数图像的结构相似性提高到0.7871和0.7972。结论 本文方法在低剂量脑灌注CT图像噪声抑制和结构保持方面均有很好的表现，并且可以获取准确的脑血流动力学参数图像。

• 降糖三黄片抑制糖尿病小鼠胰岛细胞的内质网应激和自噬

  张文婧, 胡兆霆

  目的 探讨降糖三黄片对db/db小鼠血糖调节和胰岛细胞损伤的影响以及糖脂毒性诱导的胰岛细胞内质网应激和自噬初期的保护机制。方法 40只db/db小鼠随机分为db/db、db/db+JT(L)（1.32 g/kg）、db/db+JT(H)（2.64 g/kg）、db/db+Met（0.225 g/kg），以C57BL/6J小鼠为正常组（n=10）。干预8周，检测血糖血脂等代谢指标，观察胰岛细胞形态变化。体外培养小鼠胰岛细胞（MIN6），将其分为4组：Control组（5 mmol/L葡萄糖），HH组（22 mmol/L葡萄糖+0.1 mmol/L棕榈酸），HH+JT组（高脂高糖组条件基础上+5%降糖三黄片含药血清）和HH+JT+SP600125组（降糖三黄片组条件基础上+20 μmol/lSP600125）。流式术检测MIN6凋亡，RT-qPCR和Western blot检测内质网应激与自噬初期水平。结果 与对照组相比，中药有效改善糖脂代谢水平（P<0.05），延缓体质量持续增长（P0.05）。HE染色发现降糖三黄片可修复胰岛细胞损伤。体外实验中，流式检验发现HH组胰岛细胞凋亡率显著升高（P<0.05），HH+JT组可以减缓其凋亡（P<0.05）。Western blot结果显示降糖三黄片含药血清会显著减低由高脂高糖引起的内质网应激相关蛋白以及自噬初期相关蛋白的高表达（P<0.05）。干扰内质网应激可显著降低降糖三黄片含药血清对高脂高糖诱导的MIN6损伤的保护作用以及对胰岛细胞凋亡和自噬的抑制作用（P<0.05）。结论 降糖三黄片对MIN6有保护作用，其机制可能通过抑制内质网应激和自噬实现。

• 小鼠非酒精性脂肪性肝炎早期YAP活性变化特征及其与胆管反应的时空关系

  刘雅雪, 梁嘉恩, 曾伟兰, 汪 艳

  目的 探究非酒精性脂肪性肝炎（NASH）早期Yes-相关蛋白（YAP）活性变化特点及其与胆管反应（DR）发生的时空关系。方 法 通过蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食、硫代乙酰胺（TAA）饮食喂养雄性C57BL/6J小鼠12周，构建NASH小鼠模型。通过HE、Masson染色评估肝脏病理学改变，qPCR技术检测YAP及其靶基因（Ctgf、Cyr61、Acta2）的mRNA表达情况；免疫印记检测YAP的总蛋白表达水平；免疫组化检测YAP、DR标志（K19和Sox9）表达与分布情况。结果 在MCD饮食诱导的NASH疾病早期（1~4 周），肝组织YAP及其靶基因Ctgf、Cyr6、Acta2的mRNA表达量和YAP总蛋白表达量均增加（P<0.01）。YAP阳性肝细胞数量在第2周达到峰值90.8/×400视野后，第4周减少至30.8 /×400视野（P<0.001），并在汇管区附近（即DR发生初始位置）观察到YAP阳性胆管样细胞。8~12周时可在中央静脉周围肝小叶中观察到大量的K19/Sox9阳性DR细胞（P0.05），且YAP阳性胆管样细胞数量逐渐增加（P<0.001）。在TAA饮食诱导的NASH疾病早期（3 d~2周），肝组织YAP及其靶基因Ctgf、Cyr6、Acta2的mRNA表达量和YAP总蛋白表达量均增加（P<0.05）。YAP阳性肝细胞数量在2周达到峰值69.2/×400视野；4周减少至55.2/×400视野（P<0.001），并且在中央静脉附近（即DR发生初始位置）观察到YAP阳性胆管样细胞。 6~12周时可在中央静脉周围肝小叶中观察到大量的K19/Sox9阳性DR细胞（P<0.01），同时YAP阳性肝细胞数量持续减少（P< 0.001），YAP阳性胆管样细胞数量持续增加（P<0.001）。结论 NASH损伤肝脏组织中，YAP激活早于DR发生，YAP活性变化特点及其分布与DR发生分布具有时空相关关系，同时肝细胞内的YAP激活似乎可以诱导肝细胞转分化为胆管样细胞，参与DR发生。

• MiR-let-7g-3p靶向HMGB2调控膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡

  邹震海, 程 琪, 李 中, 高五岳, 孙 巍, 刘贝贝, 郭园园, 刘建民

  目的 探讨MiR-let-7g-3p靶向HMGB2对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法 通过qRT-PCR检测膀胱癌组织和癌旁组织以及正常尿路上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞（T24、5637和EJ）中let-7g-3p的表达水平；通过转染过表达或敲低T24细胞let-7g-3p表达，检测细胞增殖、迁移和侵袭、和凋亡等变化；对过表达let-7g-3p的细胞进行转录组测序，结合生物信息学分析，通过双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Western-blot分析let-7g-3p靶向负性调控HMGB2基因；qRT-PCR检测正常尿路上细胞和膀胱癌细胞（T24、5637和EJ）中HMGB2的表达水平，并且在敲低HMGB2的细胞株中，敲低let-7g-3p，检测细胞生物学行为改变。结果 qRT-qPCR证实let-7g-3p在膀胱癌组织和细胞表达明显下调（P<0.01）；过表达let-7g-3p可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡（P<0.01）；相反，敲减let-7g-3p表达可促进细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡（P<0.01）。生物信息学和转录组测序结果显示，HMGB2是let-7g-3p作用于膀胱癌细胞的关键分子；双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Westernblot显示，HMGB2受let-7g-3p的负性调控；HMGB2膀胱癌细胞中表达水平均明显上调（P<0.01），敲低HMGB2可部分逆转敲低let-7g-3p对膀胱癌细胞生长的促进作用。结论 MiRNA-let-7g-3p通过靶向负性调控HMGB2基因抑制膀胱癌细胞的生物行为。

• 沉默A549细胞中的CD46和DSG2可抑制人3型和7型腺病毒的侵入及IL-8的释放

  杨中英, 付扬喜, 任 洛, 陈诗懿, 刘恩梅, 臧 娜

  目的 探讨沉默受体CD46、桥粒芯蛋白（DSG2）对人3型腺病毒（HAdV-3）和7型腺病毒（HAdV-7）的侵入及炎症因子释放的影响。方法 通过RNA干扰技术沉默A549细胞中CD46、DSG2的表达。实验分为HAdV-3组、HAdV-3+siRNA-NC组（siRNA无关序列对照组）、HAdV-3+siRNA-CD46组（转染siRNA-CD46）、HAdV-3+siRNA-DSG2组（转染siRNA-DSG2）；HAdV-7组、HAdV-7+siRNA-NC组（siRNA无关序列对照组）、HAdV-7+siRNA-CD46组（转染siRNA-CD46）、HAdV-7+siRNA-DSG2组（转染siRNA-DSG2）。HAdV-3、7感染A549细胞后0.5、2 h，通过激光共聚焦显微镜观察两种腺病毒与受体CD46、DSG2结合水平；体外转染siRNA-CD46、siRNA-DSG2后不同时间点，qRT-PCR技术检测HAdV-3、7拷贝数,ELISA检测转染后IL-8表达情况。结果 腺病毒感染A549细胞后0.5、2 h，HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合共定位；腺病毒入胞后，随时间延长，病毒拷贝数增加，转染 siRNA-CD46 后 2、6、12、24 h，HAdV+siRNA-CD46 组的病毒拷贝数较 HAdV 组降低（HAdV-3+siRNA-CD46 vs HAdV-3：6 h，P<0.05；12、24 h，P<0.0001；2 h,降低趋势无统计学差异；HAdV-7+siRNA-CD46 vs HAdV-7：2 h， P<0.01；6 h，P<0.001；12、24 h，P<0.0001）。转染siRNA-DSG2后2、6、12、24 h，同样明显降低了病毒载量（HAdV-3+siRNA-DSG2 vs HAdV-3，HAdV-7+siRNA-DSG2 vs HAdV-7，P<0.0001）。HAdV-3、7 感染 A549 细胞后，炎症因子 IL-8 释放增多（P<0.0001），沉默CD46和DSG2的表达后2、6 h，炎症因子IL-8水平降低（P<0.0001）。结论 HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合后入胞，病毒拷贝数随时间延长而增加，沉默CD46、DSG2后，抑制HAdV-3、7型腺病毒的侵入及IL-8释放。

• 非小细胞肺癌细胞外泌体源性FZD10促进体外血管生成

  吴小凤, 詹日明, 程大钊, 陈 黎, 王天雨, 唐旭东

  目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）细胞外泌体源性FZD10在血管生成中的作用及其机制。方法 采用超速离心法分离外泌体，并利用Western blot和RT-qPCR技术分析NSCLC细胞（95D和H1299）、正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）及其外泌体中FZD10的表达；通过转染FZD10-siRNA敲低FZD10表达，用FZD10未敲低和敲低的NSCLC细胞外泌体分别处理HUVEC细胞，利用体外血管生成实验观察其成管能力，采用ELISA和RT-qPCR技术分析血管生成相关因子VEGFA和Ang-1的表达；进一步利用Western blot分析外泌体源性FZD10对信号通路PI3K、Erk1/2和YAP/TAZ激活的影响。结果 同BEAS-2B细胞及其外泌体相比较，FZD10在95D和H1299细胞及其外泌体中高表达（P<0.01）；95D和H1299细胞来源的外泌体可促进HUVEC的微管形成及VEGFA、Ang-1的蛋白分泌、mRNA的表达（P<0.01），但在95D和H1299细胞敲低FZD10后这些效果受到抑制。FZD10的敲低可抑制PI3K、Erk1/2信号通路的激活，但对YAP/TAZ信号通路的影响不显著。结论 NSCLC细胞外泌体源性FZD10可促进体外血管生成，其机制可能与PI3K、Erk1/2信号通路的激活有关。

• 急性低氧跑大鼠的心肌损伤与心肌钙电流的变化有关

  但 晴, 白 婧, 蔡钟奇, 林 琨, 李 泱

  目的 探讨钙离子在急性低氧跑大鼠心肌损伤中的作用。方法 将40只大鼠随机分为常氧安静组（NQ）、常氧跑步组（NR）、低氧安静组（HQ）和低氧跑步组（HR），10只/组。两个低氧组每天在低压氧舱（氧分压61.6 kPa）4 h，两个运动组每天使用跑轮装置运动4 h，其中低氧跑步组在低压氧舱运动4 h。使用酶消化法分离大鼠心室肌细胞，膜片钳技术记录动作电位和电流，共聚焦钙离子成像技术检测细胞内钙离子水平，Western blotting分析该蛋白的表达。结果 与NQ组相比，HR组SOD显著降低，h-FABP显著升高（P<0.01）。HR组hs-CRP和IMA均高于NQ组（P<0.05或P<0.01）。HR组心肌纤维呈波浪形，横带增厚，部分细胞核浓缩。HR组APD50、APD90明显延长（P<0.05）。在不同的应激条件下，ICa，L电流密度均有不同程度的增加。其中，HR组的增加最为显著。HR组稳态激活曲线显著左移，稳态失活曲线显著右移。NR组、HQ组和HR组的自发性钙波事件均高于NQ组，尤其是HR组（P<0.05或P<0.01）。应激3组大鼠心肌细胞钙火花频率增加，火花幅度降低，其中HR组变化最显著。此外，与NQ组相比，应激组心室肌细胞钙释放幅度降低，钙离子回流吸收延迟。HR组Cav1.2通道和RyR2受体蛋白水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论 急性低氧运动大鼠心肌功能损害的机制与钙电流增加和细胞内钙超载有关。

• RHPN2在骨肉瘤细胞中高表达并与较差的预后相关

  刘智宇, 方锋助, 李 京, 赵广跃, 臧全金, 张 峰, 牒 军

  目的 筛选骨肉瘤细胞中异常表达的基因，探究RHPN2对骨肉瘤细胞体外增殖、凋亡和迁移能力以及对体内成瘤能力的影响。方法 采用GEO2R分析GSE70414数据集中骨肉瘤细胞与正常细胞的基因差异表达，RT-qPCR和Western blot实验检测人骨肉瘤细胞系MG-63、143B和SAOS2中RHPN2的表达情况。分别采用两种RHPN2-shRNA和对照组NC-shRNA转染143B细胞，CCK8实验、CFU实验、Annexin V-FITC/PI染色以及划痕试验分别检测RHPN2沉默对143B细胞增殖能力、凋亡和迁移能力的影响。采用143B细胞和RHPN2-shRNA转染的143B细胞原位注射构建裸鼠骨肉瘤原位瘤模型，并对肿瘤组织进行HE染色来验证RHPN2沉默对骨肉瘤细胞体内成瘤的影响。采用KM生存曲线分析RHPN2的表达与骨肉瘤患者生存预后的相关性。结果 RHPN2在骨肉瘤细胞系MG-63、143B和SAOS2中的表达明显上调（P<0.01）；RHPN2的沉默能够显著抑制骨肉瘤143B细胞的体外增殖和迁移，促进凋亡过程（P<0.01），并且抑制143B细胞的体内成瘤能力；RHPN2高表达的骨肉瘤患者的总体生存率明显低于低表达患者（P<0.05）。结论 RHPN2在骨肉瘤细胞中高表达，能够促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移，抑制凋亡，并且与骨肉瘤患者较差的预后相关。

• 激活大麻素受体2可减轻实验性脓毒症大鼠的急性肺损伤

  康惠文, 蒋守芳, 宋 倩, 章义利

  目的 探讨激活大麻素受体2（CB2）对大鼠脓毒症急性肺损伤的保护作用及机制。方法 将48只SD大鼠随机分为对照组、模型组、CB2激动剂组和P38 MAPK抑制剂组（12只/组）。对照组腹腔注射生理盐水，其余3组均腹腔注射脂多糖造模6 h；CB2激动剂组在注射脂多糖前30 min腹腔注射CB2激动剂JWH133（3 mg/kg），P38 MAPK抑制剂组在CB2激动剂组基础上提前30 min腹腔注射P38 MAPK抑制剂SB203580（5 mg/kg）。观察和检测肺组织病理学、含水率、液体清除率、炎症因子的变化情况，肺组织CB2、紧密连接的基因及蛋白表达情况以及P38 MAPK磷酸化情况。结果 与对照组相比，模型组大鼠的肺泡结构破坏严重，液体清除率、肺组织中CB2、occludin和ZO-1蛋白的mRNA及蛋白表达降低，肺组织含水率、P38 MAPK的磷酸化程度、肺灌洗液中TNF-α、IL-1β均增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，CB2激动剂组肺泡形态有所恢复，但仍有炎性浸润，肺组织含水率、P38 MAPK磷酸化程度、肺灌洗液中TNF-α、IL-1β降低，液体清除率、肺组织CB2、occludin和ZO-1蛋白的mRNA及蛋白表达增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。与CB2激动剂组相比，P38 MAPK抑制剂组肺泡结构有所恢复，肺组织P38 MAPK磷酸化程度、肺灌洗液中TNF-α、IL-1β水平降低，occludin、ZO-1蛋白表达增加，差异均有统计学意义（P0.05）。结论 CB2激活后可通过抑制P38 MAPK信号通路，降低肺组织炎症因子释放，促进紧密连接蛋白表达，对实验性脓毒症大鼠急性肺损伤起到保护作用。

• 靛玉红可减轻骨关节炎大鼠的软骨细胞炎症和损伤

  陈 昕, 齐秀春, 曹玉净, 李 扬, 李浩亮, 王前进, 艾进伟

  目的 探讨靛玉红对大鼠骨关节炎症和损伤的作用及其机制。方法 IL-1β构建骨关节炎细胞模型；0.1、0.5、1、2 μmol/L靛玉红分别与IL-1β共同处理细胞；NPAS2 siRNA或non-specific siRNA转染细胞；四甲基噻唑蓝染色法检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot检测BAX、Bcl-2、ACAN、COL2A1、MMP-13和NPAS2蛋白含量；ELISA检测细胞培养上清液NO、PGE2和TNF-α含量，实时荧光定量 PCR检测NPAS2、ACAN、COL2A1和MMP-13 mRNA含量；构建C57BL/6小鼠骨关节炎模型，Western blot检测靛玉红对骨关节组织BAX、Bcl-2、ACAN和MMP-13蛋白含量的影响。结果 0.1 μmol/L靛玉红对软骨细胞增殖、凋亡、caspase-3活性、BAX和Bcl-2蛋白表达水平无显著影响；0.5、1和2 μmol/L靛玉红上调细胞增殖量和Bcl-2蛋白含量，降低凋亡、caspase-3活性和BAX蛋白含量（P<0.05）；0.5 μmol/L靛玉红上调NPAS2、ACAN和COL2A1蛋白和mRNA含量，下调MMP-13蛋白和mRNA、NO、PGE2 和TNF-α含量（P<0.05）；干扰NPAS2表达可显著抑制0.5 μmol/L靛玉红对IL-1β诱导的软骨细胞炎症和损伤的保护作用；小鼠骨关节炎模型中BAX和MMP-13蛋白含量上升（P<0.01），而Bcl-2（P<0.05）和ACAN（P<0.01）下降；靛玉红抑制小鼠关节组织中BAX和MMP-13蛋白含量（P<0.01），上调Bcl-2和ACAN蛋白含量（P<0.05）。结论 靛玉红对骨关节炎组织具有保护作用并可能通过NPAS2调节骨关节炎软骨细胞炎症和损伤。

• MiR-125b-5p 抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭：基于靶向下调CD147的表达

  黄 珍, 沈浩明, 邓红玉, 孙丽莎, 屈 斌

  目的 探讨miR-125b-5p靶向调控细胞外基质金属蛋白诱导因子（CD147）表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响及作用机制。方法 应用荧光实时定量PCR技术（RT-qPCR）检测卵巢癌组织和癌细胞株中miR-125b-5p和CD147 mRNA的表达；构建过表达miR-125b-5p的SKOV3细胞或低表达miR-125b-5p的HO8910细胞。CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验检测过表达或低表达miR-125b-5p对卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响；使用Starbase（http://starbase. sysu.edu.cn/）生信软件预测miR-125b-5p与CD147之间的潜在互补结合位点并使用双荧光素酶报告基因实验进行验证其靶向关系；体外培养SKOV3细胞，分别转染mimic NC、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p mimic和pcDNA3.1、miR-125b-5p mimic和pcDNA3.1-CD147，转染后分为mimic NC组、miR-125b-5p mimic组、miR-125b-5p mimic组+pcDNA3.1组、miR-125b-5p mimic+pcDNA3.1-CD147组，应用RT-qPCR和Westem blot实验检测各组中miR-125b-5p水平，CD147蛋白和mRNA水平；应用CCK-8实验、Transwell实验检测各组卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果 RT-qPCR技术证实miR-125b-5p在癌组织和卵巢癌细胞株中均低表达，而CD147在癌组织和卵巢癌细胞株中均高表达（P<0.05）；选择SKOV3和HO8910细胞进行转染，过表达miR-125b-5p后的卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的能力均被抑制（P<0.05）；Starbase生信软件预测及双荧光素酶报告基因实验证实miR-125b-5p 和CD147存在一个靶向调控关系；在SKOV3细胞中转染过表达质粒和对照质粒，转染成功后，过表达miR-125b-5p组中miR-125b-5p的表达升高，而CD147的mRNA和蛋白表达明显下降（P<0.05）。过表达miR-125b-5p后再转染pcDNA3.1-CD147，CD147的mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）。Transwell实验显示过表达miR-125b-5p后卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移受到明显抑制，而过表达miR-125b-5p后再过表达CD147，卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移的能力得到增强。结论 miR-125b-5p通过负向调控CD147的表达，从而抑制卵巢癌细胞的迁移与侵袭。

• 营养状况是影响临床预后的重要因素：基于459例急性前循环大血管闭塞性卒中急诊取栓治疗患者的回顾性分析

  孙 毅, 纪亚晨, 吴康飞, 王 昊, 郭亚鹏, 许向军, 尚贤金, 杨 倩, 黄显军, 周志明

  目的 探讨营养状态对急性前循环大血管闭塞性卒中早期血管内治疗（EVT）患者90 d功能预后的影响。方法 回顾性分析2015年7月~2020年12月在皖南医学院第一附属医院（弋矶山医院）行EVT的前循环大血管闭塞患者，收集并记录患者的基线资料、实验室数据、手术资料及90 d预后。营养状态用预后营养指数（PNI）进行评估，即血清白蛋白（g/L）+5×总淋巴细胞计数（109/L）。采用单因素和多因素回归分析探究营养指标PNI与90 d功能预后的关系。结果 共纳入459例患者，平均年龄（68.29±11.21）岁，男性260例（56.6%），根据PNI分组：营养正常392例（85.4%）、中度营养不良44例（9.6%）和重度营养不良23例（5.0%）。单因素分析显示：预后良好组中无营养不良的比例高、年龄较小、糖尿病比例较低、基线血压较低、基线NIHSS评分较低、基线ASPECT评分较高、良好侧支循环及血管完全再通比例较高。多因素分析显示：除年龄、糖尿病、基线收缩压、血管成功再通、基线ASPECT评分、基线NIHSS评分及侧支循环外，PNI是EVT患者90 d预后的独立危险因素（中度比重度OR=0.245，95% CI：0.066~0.908，P=0.035；正常比重度OR=0.185，95% CI：0.059~0.581，P=0.004）。结论 营养状态是影响EVT治疗患者预后的重要因素之一。

• AZD9291通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移

  张恒毅, 庞金龙, 张语涵, 马 月, 范方田, 刘 浩

  目的 探讨AZD9291对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响。方法 体外培养鼻咽癌HNE1和CNE2Z细胞，在HNE1细胞加入浓度分别为0、0.5、1、2、4、8 μmol/L 的AZD9291，CNE2Z细胞加入分别为0、1、2、4、8、16 μmol/L的AZD9291。采用CCK8法检测细胞存活率；集落克隆实验检测AZD9291对细胞的增殖抑制作用；细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞修复和迁移能力；Western blot法检测EGFR相关信号通路蛋白及迁移相关蛋白的表达。结果 CCK8和集落克隆实验结果显示AZD9291可显著抑制HNE1和CNE2Z细胞增殖（P<0.01）；细胞划痕实验和Transwell实验结果显示AZD9291抑制HNE1和CNE2Z细胞迁移能力（P<0.01）；Western blot结果显示，随着浓度增加，AZD9291可通过调控EGFR下游PI3K-AKT-mTOR信号通路磷酸化蛋白的下调（P<0.01），抑制HNE1和CNE2Z细胞迁移（P<0.01）。结论 AZD9291可通过抑制EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制鼻咽癌HNE1和CNE2Z细胞的增殖并降低其修复和迁移能力，为后续AZD9291尝试用于鼻咽癌的治疗提供依据。

• Nur77通过NF-κB/IL-6信号途径促进胃癌细胞的侵袭与迁移

  李 蔚, 石永康, 郭玉华, 田声望

  目的 探讨孤儿核因子受体（Nur77）在胃癌组织中表达及其与患者预后状况之间联系，研究Nur77在胃癌细胞侵袭与迁移进程中的作用机制。方法 利用Oncomine数据库在线分析Nur77在胃癌及胃黏膜组织中mRNA表达情况；基于Human ProteinAtlas网站数据对比胃癌及正常胃组织中Nur77蛋白表达分布特征；GEPIA2在线分析工具评估Nur77与患者总生存期之间联系；蛋白免疫印迹法(Western blot)比较正常胃黏膜上皮细胞GES-1与胃癌细胞AGS、MKN-45中Nur77蛋白表达差异；分别通过siRNA靶向干扰以及质粒转染上调Nur77表达和靶向下调IL-6验证Nur-77与IL-6之间表达调控关系；运用划痕实验检测干扰Nur77表达前后胃癌细胞的迁移能力改变；将胃癌细胞分空载体组和过表达Nur77组以及空载体转染后干扰IL-6处理组，过表达Nur77结合干扰IL-6处理组（质粒转染24 h后siRNA继续处理24 h）经Transwell小室实验检测Nur-77及IL-6在胃癌细胞迁移和侵袭过程中作用；利用Western blot检测Nur77表达对NF-κB/IL-6信号通路活化的影响。结果 Oncomine数据库在线分析显示，与正常胃黏膜组织相比胃癌组织中Nur77的 mRNA表达水平显著升高（P<0.05）；免疫组化结果显示，胃癌组织中Nur77多表达于胃癌细胞细胞核内；Nur77的高表达与胃癌患者不良预后相关（P<0.05）；胃癌细胞中高表达的Nur77参与IL-6的表达调控；划痕实验和Transwell小室结果显示，Nur77可能通过IL-6参与胃癌细胞的迁移和侵袭进程（P<0.05）；Western blot结果显示，Nur77通过调控p-p65、p65、p-Stat3、Stat3的表达参与NF-κB/IL-6信号通路活化。结论 胃癌中高表达Nur77与患者不良预后密切相关；Nur77可能通过调控NF-κB/IL-6信号途径活化参与胃癌细胞侵袭与迁移进程。

• 新型温敏性重组人釉原蛋白载体与传统丙二醇藻酸酯载体的体外测试效果比较

  江文豪, 钱垂文

  目的 评价新型温敏性重组人釉原蛋白（rhAm）载体和传统丙二醇藻酸酯（PGA）载体的体外表征和对人牙周膜成纤维细胞活性的影响。方法 分别利用3.3%PGA与rhAm混合制备PGA-rhAm，2%的壳聚糖（CS）和rhAm混合并使用质量分数60%的β-甘油磷酸钠溶液（βGP）作为交联剂制备CS-βGP-rhAm凝胶；表征通过检测黏度、凝固时间、pH值、溶胀率、体外生物降解率和缓释性能来评估；通过观察金黄色葡萄球菌生长状况比较材料的抗菌效果；生物相容性评估是在人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）上利用CCK8检测各组细胞增殖能力，划痕实验检测细胞迁移能力，RT-qPCR检测成骨基因mRNA表达，Western blot检测蛋白的表达水平，碱性磷酸酶（ALP）染色检测各组细胞成骨分化情况。结果 PGA-rhAm具有黏度值3.262±0.055 Pa.s，CS-βGP-rhAm在37 ℃下具有6 min凝固成型能力、接近口腔环境的pH值、约90%的溶胀率，同时缓释rhAm可维持2周以上，自身降解时间维持3周以上。CS-βGP负载rhAm相比PGA负载rhAm更有效抑制金黄色葡萄球菌生长（P<0.001）。细胞水平上，CS-βGP是否负载rhAm都可促进细胞增殖（P<0.001），PGA促进细胞增殖效果不显著。划痕实验显示，CS-βGP和PGA负载rhAm后均可促进细胞迁移（P<0.01）。RT-qPCR和Western blot结果显示，CS-βGP负载rhAm能促进RUNX2、OCN mRNA水平（P<0.001），上调Ki67（P<0.001）、RUNX2（P<0.001）、Collagen Ⅰ（P<0.01）、β-catenin（P<0.05）蛋白表达。PGA负载rhAm促进RUNX2（P<0.05）、OCN（P<0.01）mRNA水平表达，蛋白水平变化无统计学意义。CS-βGP组ALP染色蓝紫色颗粒数增加，PGA组无明显变化。结论 CS-βGP具有能缓释rhAm的性能，同时相比传统的PGA载体，CS-βGP具有温度成型的特点、抑制金黄色葡萄球菌生长的性能、显著提高hPDLFs的生物活性并且负载rhAm后不影响其生物活性。

• 产后抑郁与初乳中转化生长因子-β水平的关系：90例巢氏队列研究

  熊紫玉, 周乐鹏, 陈静芬, 李 萌, 谢日华

  目的 探究产后抑郁（PPD）与初乳转化生长因子-β（TGF-β）水平的关系。方法 于2020年12月~2021年9月在广东省某家三级综合医院建立的母婴队列中招募产妇。产后第2天下午，采用爱丁堡产后抑郁量表（EPDS）对产妇进行筛查，评分≥10分者为产后抑郁产妇（PPD暴露组），并按1∶1配比（年龄±5岁、分娩方式相同）正常产妇（PPD非暴露组）。产后第3天上午，采集初乳标本并采用酶联免疫法测定其TGF-β水平。分析比较两组产妇初乳TGF-β水平，并探究其与EPDS评分的相关性。结果 共招募90例产妇。PPD 暴露组产妇初乳TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的水平分别为 684.03（321.22，859.25）pg/mL，（5116.50±1747.04）pg/mL及（147.84±48.68）pg/mL；而PPD非暴露组产妇初乳TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的水平分别为745.67（596.00，964.22）pg/mL，（4912.40±1516.80）pg/mL及（168.21±48.15）pg/mL。PPD暴露组产妇初乳TGF-β1（P=0.026）和TGF-β3（P= 0.049）水平显著低于正常产妇。Spearman相关分析显示初乳TGF-β1（r=-0.23，P=0.03）及TGF-β3（r=-0.25，P=0.02）水平与EPDS评分呈负相关。结论 初乳TGF-β1和TGF-β3水平降低与PPD有关，提示我们应加强孕产期PPD的早期筛查与早期干预，降低其对母乳成分的影响，从而促进婴幼儿健康发育。