南方医科大学学报杂志

南方医科大学学报杂志2021年第1期

• 罕见宫颈大细胞神经内分泌癌患者的维持妊娠与母婴管理

  戴戈扬, 陈高文, 李肖璇, 郑友红, 王 袁, 李兴嵩, 李 菁, 周 璟, 谢 郁, 王沂峰

  目的 探讨妊娠合并生殖道神经内分泌肿瘤(NETs)患者维持妊娠及母婴管理策略。方法 结合癌灶体细胞系与母子胚系WGS测序和系统分析妊娠合并生殖道NETs报道病例诊疗方案，优化罕见宫颈大细胞NETs合并妊娠的诊疗策略。结果 病例分析提示阴性淋巴结转移和FIGO分期早与患者良好预后相关，评价本病例后采用维持妊娠治疗，经新辅助化疗等综合措施，随访迄今19月母子健康。WGS发现6个体细胞系错义致病性突变，其中KARS、VEGFA等与靶向药物选择相关；母子胚系共发现5个致病性肿瘤易感基因突变。结论 优化临床处置策略，妊娠合并宫颈NETs患者可获得良好母婴结局；WGS有利于制定精准的临床诊疗与随访方案。

• 白藜芦醇治疗阿尔茨海默病的作用机制：基于网络药理学方法

  方迎艳, 苏振宏, 司文霞, 刘圆呈, 李 洁, 曾 鹏

  目的 基于网络药理学方法探讨白藜芦醇（RES）治疗阿尔茨海默病（AD）的作用机制。方法 利用PubChem、BATMAN-TCM、Genecards、AD、TTD、String 11.0、AlzData、SwissTargetPrediction、Metascape等数据库，获得RES所有作用靶点和人类AD相关的靶点，使用Venny 2.1工具取交集，获得RES治疗AD的靶点。构建靶点蛋白质相互作用网络，基因本体论（GO）与KEGG通路富集分析，使用Cytoscape 3.7.1构建RES治疗AD的“靶点-信号通路”网络图。使用SwissDock（http://www.swissdock.ch/docking）服务器进行分子对接验证。通过蛋白免疫印迹检测RES处理AD细胞模型（293Tau细胞）的pS396、pS199、Tau5、CDK5、糖原合酶激酶3β（GSK3β）和p-GSK3β的蛋白水平。结果 分析得到RES作用靶点182个，AD相关靶点525个，RES治疗AD的靶点36个，其中34.6%的靶点为蛋白质修饰酶、27.7%的靶点为代谢物相互转化酶、13.8%的靶点为基因特异性转录调节因子、10.3%的靶点为转运蛋白。RES治疗AD的核心关键靶点为INS、APP、ESR1、MMP9、IGF1R、CACNA1C、MAPT（即微管相关蛋白Tau）、MMP2、TGFB1与GSK3B。GO生物学过程富集分析显示，RES治疗AD主要涉及对β-淀粉样蛋白的反应、转移酶活性的正调节、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、行为、学习或记忆、老化、跨膜转运的调控等多个生物功能。KEGG通路富集分析表明富集最显著的信号通路为阿尔茨海默病通路、PI3K-AKT信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路等。分子对接结果显示，RES与ESR1、GSK3B、MMP9、IGF1R、APP与INS结合较好。蛋白免疫印迹结果显示，50 μmol/L RES处理12 h可以通过调控CDK5、核心靶点GSK3β活性显著降低293Tau细胞pS396和pS199水平（P<0.001）。结论 RES可以通过Aβ、Tau病理过程治疗AD，可通过调控CDK5与GSK3β改善AD病理改变。

• 连花清瘟胶囊提高 COVID-19 临床治愈率的机制：基于网络药理学和分子对接技术

  鄢海燕, 邹纯才

  目的 基于网络药理学和分子对接技术探讨连花清瘟胶囊提高COVID-19临床治愈率的作用靶点、信号通路和生物学功能。方法 利用TCMSP、SwissTarget Prediction、CooLGeN、GeneCards、DAVID等数据库，以连花清瘟胶囊中的连翘、金银花、炙麻黄等13味药来检索活性成分及其靶点蛋白，筛选与COVID-19及其临床表现（发热、咳嗽、乏力）共有的靶点蛋白及其信号通路与生物学功能，采用Gephi软件构建连花清瘟胶囊药味-活性成分-作用靶点-生物学功能网络图。结果 连花清瘟胶囊中的连翘、金银花、炙麻黄等13味药中的MOL000522、MOL003283、MOL003365、MOL003006、MOL003014等160个活性成分通过MAPK1、IL6、HSP90AA1、TNF、CCL2 等 57 个靶点蛋白、NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway等35条信号通路发挥治疗COVID-19或干预COVID-19病变过程的作用，影响COVID-19的临床表现。分子对接结果表明，MOL000522（来自连翘）、MOL001495（来自金银花）、MOL001494（来自金银花、炙麻黄）等83个化学成分与MAPK1、IL6、HSP90AA1等12个靶点蛋白的Total Score 分值≥5.0，可形成稳定构象，具有较好结合活性。其中，Total Score 值≥9.0的有：MOL000522（来自连翘）-MAPK1、MOL004989（来自甘草）-MAPK1、MOL003330（来自连翘）-MAPK1、MOL001495（来自金银花）-NLRP3、MOL001494（来自金银花、炙麻黄）-NLRP3、MOL004908（来自甘草、苦杏仁）-HSP90AA1、MOL004863（来自甘草）-HSP90AA1、MOL001749（来自板蓝根）-TLR9、MOL004806（来自甘草）-HSP90AA1、MOL001495（来自金银花）-AKT1。结论 连花清瘟胶囊以多药味、多靶点、多信号通道和多生物学功能发挥提高COVID-19临床治愈率作用。

• 长链非编码RNA Kcnq1ot1促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化

  章 坤, 时哲敏, 任 怡, 韩晓辉, 王敬朝, 洪 伟

  目的 探究长链非编码RNA Kcnq1ot1对成骨细胞分化和破骨细胞分化的调控作用。方法 运用荧光实时定量PCR技术分别在卵巢去势（双侧卵巢切除，n=8）、鼠尾悬吊（后肢悬空，n=14）以及自然衰老（正常饲养至18月龄，n=8）引起的骨质疏松小鼠以及各自对照小鼠（n=6）股骨组织中，小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1向成骨细胞分化过程中以及小鼠骨髓源巨噬细胞BMMs和小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7向破骨细胞分化过程中检测lnc-Kcnq1ot1、骨钙素（Bglap）、Runt相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶基因（Alp）、骨涎蛋白（Bsp）、活化T-细胞核因子c1（Nfatc1）、基质金属蛋白酶9（Mmp9）、组织蛋白酶K（Ctsk）和破骨细胞相关受体（Oscar）的表达水平；运用两对特异性以慢病毒为载体的短发夹RNAs（Lv-shRNAs）或小干扰RNAs（siRNAs）在MC3T3-E1、BMMs和RAW264.7细胞诱导分化过程中沉默lnc-Kcnq1ot1，随后运用荧光实时定量PCR技术检测lnc-Kcnq1ot1、成骨相关基因（Bglap、Alp）和破骨相关基因（Ctsk、Oscar）的表达；运用ALP染色检测碱性磷酸酶活性；运用抗酒石酸磷酸酶染色检测抗酒石酸磷酸酶活性。运用核浆分离联合荧光实时定量PCR技术检测lnc-Kcnq1ot1亚细胞定位。结果 与对照相比，lnc-Kcnq1ot1在卵巢去势、鼠尾悬吊以及自然衰老引起的疏松股骨组织中表达显著降低（P<0.05）；在MC3T3-E1向成骨细胞分化过程中表达增多（P<0.05）；在小鼠BMMs和RAW264.7向破骨细胞分化过程中表达显著降低（P<0.05）。在MC3T3-E1细胞中，沉默lnc-Kcnq1ot1抑制Bglap和Alp的表达（P<0.05），并减弱成骨诱导剂引起的成骨细胞分化；在小鼠BMMs和RAW264.7细胞中，沉默 lnc-Kcnq1ot1 促进 Ctsk 和 Oscar 的表达（P<0.05），并加重 RANKL 诱导的破骨细胞分化。核浆定位显示 lnc-Kcnq1ot1主要定位在MC3T3-E1和RAW264.7细胞核内。结论 lnc-Kcnq1ot1促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化，可能成为骨质疏松症的一个潜在治疗靶点。

• 博莱霉素诱导小鼠肺纤维化中差异表达的 mRNA 及其与LncRNA的共表达网络关系

  喻雪飞, 李 理, 郑林鑫, 李伟峰

  目的 研究博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中mRNA/LncRNA表达谱的变化，筛选出肺纤维化相关的mRNA，与差异LncRNA进行编码-非编码共表达（CNC）生物信息学分析。方法 采用气管内注射博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。SPF级C57BL/6小鼠随机分为模型组（10只/组，向心端气管内注入100 μL博来霉素溶液3 mg/kg）及对照组（10只/组，注入等量的0.9%的氯化钠注射液），于14 d时处死大鼠留取肺组织。通过Masson染色和HE染色评估组织肺纤维化程度。利用LncRNA芯片技术筛选肺纤维化过程中差异表达的mRNA与LncRNA表达谱，通过NCBI数据库、UCSC数据库等对差异mRNA进行GO及pathway 等生物信息学分析，筛选出纤维化可能相关的 mRNA，通过 qRT-PCR 验证其表达变化，进一步与所有差异表达LncRNA进行CNC共表达分析，构建纤维化可能相关mRNA与差异LncRNA共表达网络。结果 模型组肺组织纤维化程度显著高于对照组。基因芯片显示与对照组相比，模型组中表达上调的mRNA有 127个，表达下调的有184个，GO及pathway分析发现差异表达的基因在生物学功能上主要涉及免疫反应、细胞分化、细胞骨架等；参与的信号通路主要有细胞因子与细胞因子受体相互作用、趋化因子信号转导通路等。生物信息学分析发现纤维化相关mRNA与差异表达的LncRNA存在显著的共表达网络关系。结论 本研究筛选出小鼠肺纤维化发生过程中差异变化mRNA/LncRNA表达谱，生物信息学分析得出纤维化相关mRNA确实与大量差异的LncRNA存在高度相关的共表达关系。

• 健康适能评定量表评价广州市大学生健康适能状况的信效度

  刘 倩, 黄 晨, 蒋丽洁, 邱 恒, 许 军

  目的 评价健康适能评定量表（Healthy Fitness Measurement Scale V1.0，简称HFMS V1.0）应用于广州市大学生健康适能状况的信效度。方法 用HFMS V1.0量表对584名大学生进行现场测试，通过条目区分度、Cronbach'α系数、折半信度、重测信度、内容效度、结构效度、校标效度及反应度等指标考评HFMS V1.0量表的信效度。结果 HFMS V1.0总量表的Cronbach'α系数为0.893，Guttman系数为0.909，重测系数为0.923。各维度与其子量表间相关系数为0.687~0.931，各条目与其维度相关系数为0.558~0.863（P<0.05）。探索性因子共抽取8个因子，方差解释度为55.105%，因子结构与量表理论设想基本一致。验证性因子分析显示，修正后拟合统计量为：χ2 /DF=1.952、RMSEA=0.400、GFI=0.906、TLI=0.905、IFI=0.914、CFI=0.913（P<0.05），模型拟合良好。4个总体评价条目与其对应量表的相关性为0.585~0.670。量表最高分与最低分所占比例均很低，反应度较好。结论 HFMS V1.0应用于评价大学生健康适能水平状况具有较好的信效度，可以为大学生健康适能水平状况的评价提供一个可靠、准确、有效的测量工具。

• NDUFA13失活在诱导小鼠自发性肝炎病理进程中的作用及机制

  徐小惠, 李 锐, 曾 欣, 王 欣, 薛炳乾, 黄道超, 黄 轶

  目的 构建线粒体蛋白（NDUFA13）基因肝特异性敲除小鼠，探讨NDUFA13表达失活在小鼠自发性肝炎病理进程中的作用及可能机制。方法 采用Cre/loxP转基因技术，将NDUFA13 flox基因编辑小鼠NDUFA13fl/fl与Alb-Cre转基因小鼠杂交，得到肝脏特异性NDUFA13杂合敲除（NDUFA13fl/-；Alb-Cre）小鼠。经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，对鼠尾与肝脏DNA基因进行分型鉴定。以同窝NDUFA13fl/fl小鼠为对照，将肝脏特异性NDUFA13fl/-小鼠作为研究对象，10只/组，分别在4周龄、2年龄时各处死5只，获取小鼠肝组织样本，通过HE染色分析肝组织病理变化，免疫组化分析NDUFA13、NF-κB/p65、NF-κB/p-p65及炎症小体NLRP3的表达，ROS染色试剂盒分析细胞总ROS及线粒体ROS水平；免疫组化与免疫荧光分析免疫细胞标志物CD45、MPO、F4/80以及炎症因子IL1β、IL33的表达情况。结果 PCR鉴定结果显示成功建立肝特异性NDUFA13杂合敲除小鼠；HE染色显示4周龄与2年龄NDUFA13fl/-小鼠肝组织均损伤严重；免疫组化检测显示，4周龄与2年龄NDUFA13fl/-小鼠NDUFA13蛋白表达显著下调（P<0.05），NF-κB信号分子p65、p-p65（Ser536）及炎症小体NLRP3蛋白表达显著增加（P<0.05）；ROS测定发现NDUFA13基因杂合敲除导致小鼠肝脏细胞总ROS、线粒体ROS水平均显著增加；免疫组化与免疫荧光结果显示，肝组织CD45、MPO、F4/80等炎症细胞标志物的聚集以及IL1β、IL33等炎症因子的分泌均明显增多（P<0.05）。结论 NDUFA13蛋白表达失活可诱导小鼠自发性肝炎病理表型，其机制可能与活化的ROS/NF-κB/ NLRP3信号通路相关。

• 米库氯铵持续输注用于全凭静脉麻醉下甲状腺手术的最大剂量：30例神经功能监测的序贯试验

  陈永杰, 王 博, 姚 兰, 冯泽国

  目的 利用序贯法探讨持续输注米库氯铵用于不影响全凭静脉麻醉下甲状腺手术术中神经功能监测的最大输注剂量，并观察其不良反应。方法 纳入30例进行甲状腺手术术中神经功能监测的患者序贯地进行试验。术中以丙泊酚复合瑞芬太尼维持麻醉深度。手术中当4个成串刺激比值升至90%以上时开始持续输注米库氯铵，以14.97 μg·kg-1·min-1为起始剂量，根据前1例患者对神经功能监测仪的反应来上调或者下调下1例患者的米库氯铵输注剂量。通过Brownlee上下序贯法来计算求得米库氯铵的EC50及95%CI。术中观察是否体动、皮肤潮红情况，记录对比诱导注射肌松药即刻（T0）、诱导肌松药给药5 min（T1）、术中输注肌松药即刻（T2）、术中输注肌松药10 min（T3）、术中输注肌松药20 min（T4）5个时点平均动脉压和心率。结果 持续输注米库氯铵且不影响全凭静脉麻醉下甲状腺手术术中神经功能监测的EC50为18.9 μg·kg-1·min-1，95%可信区间为17.3~20.5 μg·kg-1·min-1。1例（3.3 %）患者诱导后出现一过性双脸颊皮肤发红，所有患者均未出现插管困难及术中体动，T0、T1、T2、T、T4任意两时点平均动脉压值两两比较、任意时点心率值两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 采用全凭静脉麻醉维持的甲状腺手术中，持续输注米库氯铵且不影响甲状腺手术术中神经功能监测的EC50为18.9 μg·kg-1·min-1，95%可信区间为17.3~20.5 μg·kg-1·min-1。术中未见严重不良反应。

• 替莫唑胺诱导的小鼠胶质瘤耐药动物模型的建立

  施林勇, 李 宏, 辜俊伟, 宋 憧, 李俊杰, 陈 磊, 周 强, 漆松涛, 陆云涛

  目的 通过颅内原位成瘤小鼠体内连续传代技术，建立更为有效的替莫唑胺（TMZ）耐药胶质瘤模型，评估其耐药性和相关生物学特性。方法 取成年C57BL/6小鼠78只，按随机数字表法分为6组（13只/组）：诱导组共3组（小剂量、中剂量和大剂量诱导组），对照组共3组（不给药组、中剂量和大剂量对照组）。每组中5只磁共振评估肿瘤大小，5只观察小鼠生存，3只取肿瘤行原代培养。使用GL261鼠胶质瘤细胞系，对诱导组1和对照1、2、3组小鼠行原位成瘤。诱导组1使用小剂量TMZ（5 mg/kg）诱导5 d后停药10 d，再将诱导组1小鼠取瘤制备单细胞悬液，流式分选得到胶质瘤细胞后继续培养，用于接种诱导组2。中剂量TMZ（25 mg/kg）处理诱导组2荷瘤鼠，同法取瘤分选后培养并接种诱导组3，大剂量TMZ（50 mg/kg）处理诱导组3荷瘤鼠。以此逐代适度递增药物剂量诱导耐药，建立小鼠胶质瘤TMZ耐药模型。对照组1使用不含TMZ的溶剂对照处理，对照组2、3分别使用中、大剂量（25、50 mg/kg）TMZ处理。细胞集落法检测每代小鼠原位肿瘤细胞的TMZ耐药性；CCK8法检测TMZ作用下的细胞耐药指数。结果 成功建立了小鼠胶质瘤TMZ耐药模型并确定了其耐药性。大剂量诱导组细胞相对集落率明显高于大剂量对照组（P<0.05），相比于不给药组产生了4.25倍耐药性。大剂量TMZ能明显减小对照组荷瘤鼠肿瘤体积（P<0.05），而大剂量诱导组肿瘤体积明显大于大剂量对照组（P<0.001），且荷瘤鼠生存时间较大剂量对照组明显缩短（P=0.0018）。结论 逐代适度递增药物剂量刺激原位成瘤小鼠，能建立更为有效的小鼠胶质瘤TMZ耐药株模型。

• HSPB1基因罕见变异可能与肌萎缩侧索硬化发病相关

  陈君逸, 刘向一, 徐迎胜, 樊东升

  目的 探讨HSPB1基因罕见变异与肌萎缩侧索硬化（ALS）发病的相关性。方法 对166例中国ALS患者进行二代测序基因检测，筛选出HSPB1基因可能的致病性罕见变异，分别与千人计划及国内全外显子测序健康对照数据库比对分析，进行序列核关联性检验（SKAT）及优化的SKAT（SKAT-O）。结果 本研究共筛选出3个HSPB1基因可能的致病性罕见变异：c.379C>T（p.R127W）、c.446A>C（p.D149A）及c.451A>C（p.T151P），均为错义突变。以千人计划作为对照，SKAT p=3.61×10-7，SKAT-O p=1.62×10-6；以国内全外显子测序健康对照数据库作为对照，SKAT p=9.99×10-4，SKAT-O p=1.80×10-3。未发现该基因罕见变异携带者的特征性临床表型特点。结论 HSPB1基因罕见变异可能与ALS发病存在相关性。

• CCN3对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的影响

  陈世钰, 苏 欣, 刘俊平, 石宇彤, 吴敏敏, 徐梦歧, 张凤梅, 唐 敏

  目的 探究肾母细胞瘤过表达因子（NOV/CCN3）对间充质干细胞增殖的影响及调控机制，为CCN3能否作为促增殖因子在骨组织工程的应用提供理论依据。方法 以小鼠成纤维细胞（MEFs）为间充质干细胞模型，利用重组腺病毒Ad-CCN3和Ad-siCCN3分别上调、下调MEFs中CCN3表达；流式细胞术检测不同处理组细胞周期、凋亡变化情况；Western blot检测增殖指标PCNA、周期蛋白cyclin E、cyclin B1以及凋亡指标Bax、Bcl-2蛋白表达量，明确CCN3对MEFs增殖和凋亡的影响；ELISA检测CCN3蛋白分泌水平；RT-qPCR和Western blot检测Notch信号通路经典受体Notch1、配体DLL1、下游关键蛋白和/或基因Hey1、p300、H3K9，以及MAPK通路相关蛋白ERK1+2和p-ERK1+2表达变化情况。结果 流式细胞术结果显示：与对照组相比，Ad-CCN3组细胞增殖指数增加（P<0.01），细胞凋亡百分比减少（P<0.05）；且相关增殖凋亡指标PCNA、cyclin E、Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）；RT-qPCR和Western blot结果显示过表达CCN3明显促进Notch信号通路中Notch1表达（P<0.01），但抑制DLL1和Hey1、p300、H3K9等表达（P<0.05）；而MAPK通路中ERK1+2和p-ERK1+2蛋白表达增加（P<0.01）。结论 CCN3可能通过与Notch1结合，抑制经典Notch信号通路，激活MAPK通路，促进MEFs增殖、抑制细胞凋亡，从而增加MEFs细胞数量，提示CCN3具有作为间充质干细胞的促增殖因子在骨组织工程发挥作用的潜在价值。

• 二氢杨梅素通过抑制Akt/stat3信号途径的活化和HMGB1的表达降低胃癌细胞的增殖和迁移能力

  王胜男, 葛 菲, 蔡田雨, 齐世美, 戚之琳

  目的 探讨二氢杨梅素（DHM）对胃癌细胞增殖和迁移的抑制作用及潜在分子机制。方法 BGC-823细胞常规培养，实验分为对照组和不同浓度的DHM处理组。不同浓度的DHM（0、40、60、80、100、120 μg/mL）处理细胞24 h，CCK-8实验检测细胞存活率；克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；Tranwell实验检测细胞迁移能力；ELISA检测MMP-2和MMP-9的表达水平；Western blot检测N-cadherin、E-cadherin、CyclinD1、CyclinE1、HSP70、HMGB1的表达及Akt、stat3的磷酸化。结果 CCK-8表明，DHM浓度依赖性的抑制胃癌细胞的存活；克隆形成实验显示，DHM处理组，细胞克隆数明显低于与对照组（P<0.05）；Transwell结果发现，DHM处理组，迁移的细胞数量明显低于对照组（P<0.05）；Western blotting结果表明，DHM能够抑制周期蛋白Cyclin D1，E1和间质细胞标志蛋白N-cadherin的表达，增强上皮细胞标志蛋白E-cadherin的表达；明显抑制Akt和stat3的磷酸化和HMGB1的表达；ELISA结果显示，DHM浓度依赖性的抑制MMP-2，MMP-9的水平（P<0.05）。结论 DHM通过抑制Akt/stat3信号途径的活化以及HMGB1的表达，抑制胃癌细胞的增殖和迁移。

• 双酚A对小鼠卵巢腔前卵泡颗粒细胞凋亡和卵巢发育的影响

  梁 猛, 周今朝, 孙训英, 贺超凡, 张克甲, 胡 柯

  目的 探索环境雌激素双酚A（BPA）对小鼠卵巢腔前卵泡颗粒细胞凋亡和卵巢发育的作用及机制。方法 选取10 d ICR雌性小鼠，分离小鼠卵巢腔前卵泡颗粒细胞进行体外培养。予以不同浓度（0、1、10、50、100、150、200和500 μmol/L）BPA处理卵巢腔前卵泡颗粒细胞，CCK-8方法检测细胞增殖活力，流式细胞仪分析细胞周期、凋亡和线粒体膜电位变化，Western blot检测Bcl-2、Bax、p53和CyclinD1蛋白表达水平。根据对腔前卵泡颗粒细胞效应显著的BPA浓度灌胃处理ICR孕鼠1周，记录孕鼠的体质量变化，子代出生以后分别取10、17、21和42 d子代雌鼠卵巢组织称质量，然后进行卵巢组织切片HE染色及显微镜形态学观察，qPCR检测Bcl-2 mRNA水平。结果 与对照组比较，低浓度BPA（50 μmol/L）通过增加线粒体膜电位来抑制卵巢腔前卵泡颗粒细胞凋亡，进而促进细胞增殖（P<0.05）；高浓度BPA（200 μmol/L）通过减弱线粒体膜电位来促进卵巢腔前卵泡颗粒细胞凋亡，进而抑制细胞增殖（P<0.05）。低浓度BPA（50 μmol/L）和高浓度BPA（200 μmol/L）对卵巢腔前卵泡颗粒细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2（P<0.01）、Bax（P<0.05）和p53（P<0.05）表达具有相反效应。体内实验表明，BPA（10 和35 mg/kg）处理导致孕鼠体质量增加较快及子代雌鼠卵巢指数发生变化，Bcl-2 mRNA表达与子代卵巢指数变化趋势相似，并且高浓度BPA（35 mg/kg）能够促使子代雌鼠21 d时卵泡发育加速进入有腔卵泡阶段。结论 BPA对卵巢腔前卵泡颗粒细胞功能调控具有浓度依懒性，并对孕鼠和子代雌鼠早期卵巢发育具有潜在影响。

• 人参皂苷20(S)-Rg3通过抑制DNMT3A介导的启动子甲基化促进卵巢癌细胞中抑癌基因VHL的表达

  王莉洁, 韩 曦, 郑 霞, 周园园, 侯惠莲, 陈 葳, 李 旭, 赵 乐

  目的 明确人参皂苷20(S)-Rg3促进卵巢癌细胞抑癌基因von Hippel-Lindau（VHL）表达的机制。方法 Real-time PCR和Western blotting检测20(S)-Rg3处理前后卵巢癌细胞SKOV3中的VHL、DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的mRNA和蛋白水平。Real-time PCR检测甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理卵巢癌细胞SKOV3前后VHL的mRNA水平变化。甲基化特异性PCR（MSP）检测20(S)-Rg3单纯处理组和20(S)-Rg3处理且过表达DNMT3A组的VHL基因启动子区的甲基化水平，并检测VHL的mRNA和蛋白表达水平。免疫组化检测课题组前期获得的20(S)-Rg3处理组及对照组的裸鼠皮下移植瘤组织中VHL和DNMT3A的蛋白表达。结果 20(S)-Rg3处理后，卵巢癌细胞SKOV3中VHL的mRNA水平升高到阴性对照细胞的2倍以上，蛋白水平亦上调（P<0.05）；DNMT3A的mRNA水平和蛋白水平均下降（P<0.05），DNMT3B的mRNA水平略有升高但蛋白水平无明显变化（P>0.05），DNMT1的mRNA和蛋白水平均无变化（P>0.05）。2 μmol/L和5 μmol/L的5-Aza-CdR处理后，SKOV3细胞的VHL mRNA水平升高到阴性对照细胞的3倍以上（P<0.05）。20(S)-Rg3使VHL基因启动子区的甲基化水平降低（P<0.05），在20(S)-Rg3处理的同时过表达DNMT3A，则VHL基因启动子甲基化水平再次升高，同时VHL mRNA和蛋白水平均降低（P<0.05）。免疫组织显示，相对于对照组，20(S)-Rg处理组的裸鼠皮下移植瘤组织中VHL的表达上调、DNMT3A的表达下调。结论 20(S)-Rg3通过抑制DNMT3A介导的启动子甲基化而促进卵巢癌细胞中VHL的表达。

• 24 h眼压测量策略：41例前瞻性临床研究

  秦佳音, 王熙娟, 李明武, 任泽钦

  目的 分析目前临床上普遍采用的24 h眼压测量策略对于一日眼压波动的代表性。方法 纳入2018年9月~2019年1月，我院门诊诊断为“可疑青光眼”的患者，对其进行24 h眼压测量。测量时间点为：0:00，2:00，5:00，7:00，8:00，10:00，11:00，14:00，16:00，18:00，20:00，22:00，称为策略1。其中，5:00，7:00，10:00，14:00，18:00，22:00作为策略2的测量时间点；8:00，11:00，14:00，16:00作为策略3的测量时间点。分别将策略2和策略3与作为金标准的策略1进行比较。采用Goldmann 压平眼压计由同一名测量者完成测量。结果 共纳入41例患者82眼。策略1、策略2和策略3的峰值眼压分别为：21.09±4.15 mmHg、20.54±4.10 mmHg和19.91±4.38 mmHg，差异有统计学意义（P<0.05）；谷值眼压分别为：13.93±3.38 mmHg、14.63±3.49 mmHg和15.46±3.63 mmHg，差异有统计学意义（P<0.05）。策略1和策略2峰值眼压的共现性为74.39%，策略1和策略3峰值眼压的共现性为43.90%。策略2和策略3对于发现24 h眼压波动幅度的敏感性分别为55.56%和36.11%。结论 对于可疑青光眼患者，一日4次或6次眼压测量无法精确的反映出眼压波动的幅度，容易造成漏诊。

• 限制性液体管理策略对重型颅脑损伤患者的临床效果：51例前瞻性随机对照临床试验

  赵士兵, 徐德才, 李 锐, 邹 琪, 陈真真, 汪华学, 何先弟

  目的 探讨限制性液体管理策略对重型颅脑损伤患者的应用效果。方法 采用前瞻性随机对照研究，选择蚌埠医学院第一附属医院2019年1月~2020年6月收治的预计ICU住院时间≥7 d的重型颅脑损伤术后患者，按随机数字表法，分为治疗组（行限制性液体管理策略，n=25），对照组（行常规液体管理策略，n=26）。收集手术时间、术中液体平衡数据，分别在术后入ICU时和入ICU 1、3、7 d行超声测量视神经鞘直径（ONSD）、大脑中动脉搏动指数（MCA-PI）、下腔静脉直径（IVC），并收集相应时间点格拉斯哥昏迷评分（GCS）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、瞳孔直径、平均动脉压、心率、累计液体平衡等资料，记录机械通气时间、ICU住院时间和28 d病死率。结果 两组患者在手术时间、术中液体平衡、入ICU时ONSD、MCA-PI、IVC等方面差异没有统计学意义（P>0.05）。累计液体平衡：两组1 d均为正平衡，3~7 d为负平衡，相同时间点，治疗组负平衡量显著大于对照组（P<0.05），且随治疗时间延长，负平衡量不断加大。ONSD、MCA-PI 均呈现先高后低的趋势，两组1 d就较基线增大（P<0.05），组间无差异（P>0.05），3 d达到峰值，7 d下降，相同时间点治疗组明显低于对照组（P<0.05）。NSE在1 d两组无差异（P>0.05），在3 d升高到峰值，对照组更高（P<0.05），7 d治疗组回落至1 d水平，对照组仍高于1 d。两组28 d病死率无明显差异（P>0.05），治疗组机械通气时间、ICU住院时间、气管切开数量均少于对照组（P<0.05）。 结论 应用限制性液体管理策略能更好地实现液体负平衡，减轻脑水肿，降低ONSD、MCA-PI，改善NSE、GCS等预后指标，减少机械通气时间和ICU住院时间，降低气管切开率，但对28 d病死率无影响。

• gsdmd基因敲除巨噬细胞RAW 264.7的构建：基于CRISPR/Cas9 系统

  周丽婷, 叶 颖, 原海波, 吴超逸, 吴淑燕

  目的 利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW 264.7，为研究gasdermin D（GSDMD）在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法 针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA（sgRNA），构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定，将Cas9质粒和pGL3-sgRNA串联载体分两步电转至巨噬细胞RAW 264.7；qPCR检测cas9的表达；嘌呤霉素筛选出阳性单克隆后PCR、Western blot和测序鉴定。将鼠伤寒沙门菌与gsdmd-/-RAW 264.7细胞共培养，Annexin Ⅴ/PI染色及比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放水平分析细胞死亡情况。结果 qPCR结果表明获得稳定表达cas9的RAW 264.7-Cas9细胞（P<0.01）；PCR 及测序证明 pGL3-sgRNA 串联载体构建成功；PCR、测序及 Western blot 结果表明成功构建 gsdmd-/- RAW 264.7 细胞。Annexin Ⅴ/PI染色及LDH释放水平发现敲除gsdmd可降低巨噬细胞死亡率（P<0.01）。结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞，为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡及其机制奠定基础。

• 手持式视网膜视力计、光学相干断层成像技术对白内障合并黄斑前膜患者的术后视力预测

  李红阳, 黎燕英, 薛丽萍, 邹红蕾, 梁仁隆, 杨兵花, 吴 艺

  目的 探讨手持式视网膜视力计和光学相干断层成像技术（OCT）对白内障合并黄斑前膜患者的术后视力预测的意义和临床应用价值。方法 回顾分析2019年1月~2020年4月在我院因老年性白内障进行“超声乳化白内障摘除联合人工晶状体植入术”的患者。根据术前检查结果，发现白内障患者的眼底合并有特发性黄斑前膜，以LOCSⅡ晶体混浊分类标准，选取晶体混浊分级为C2N2P1的患者，共45例52 眼。并以黄斑中心凹厚度作为分组依据，将患者分为3组：在OCT检查下黄斑中心凹厚度<300 μm为A 组（9 眼），300~400 μm为B 组（25 眼），>400 μm为C 组（18 眼）。比较3组患者术前最佳矫正视力、术前视网膜视力、术后第1天最佳矫正视力、术后 3 月的最佳矫正视力。分析术前视网膜视力与术后3月最佳矫正视力的一致性。结果 3组患者术后1 d、术后3月最佳矫正视力与术前比较差异均有统计学意义（P<0.05）。3 组大部分患者术后最佳矫正视力恢复到0.3~0.5。黄斑中心凹厚度<400 μm的患者，白内障术后视力≥0.3有31 例（91.18 %）。黄斑中心凹厚度>400 μm，白内障术后视力≥0.3只有14 例（77.78 %）。术前视网膜视力和术后 3 月最佳矫正视力之间有正相关关系（r=0.830，P<0.05）。结论 合并特发性黄斑前膜的白内障患者，超声乳化白内障摘除联合人工晶状体植入术可以提高患者的术后视力。手持式视网膜视力计能准确评估C2N2P1分级白内障患者术后的视力。黄斑前膜引起黄斑中心凹厚度>400 μm的患者，单纯行超声乳化白内障摘除联合人工晶状体植入术，术后视力恢复不理想。

• 全身麻醉影响4~6岁鼾症儿童术后首夜褪黑素的分泌但不造成抑制

  邱倩琪, 宋兴荣, 孙昌志, 谭永红, 徐颖怡, 黄桂亮, 张 娜, 李峥科, 魏 伟

  目的 评价全身麻醉对4~6岁鼾症儿童术后褪黑素分泌的影响。方法 选择4~6岁拟行腺样体切除术的鼾症儿童20例，性别不限，ASA分级I或II级。通过术前、术中、术后3 d共11个相对应时间点（T1~T11）测量唾液褪黑素，测量相同时间点的光照度和患儿体温情况，记录患儿3 d夜晚睡眠时长及术后疼痛评分（FLACC）、镇静躁动评分（Riker）和康复质量评分量表-15（QoR-15），随访术前和术后28 d儿童睡眠呼吸障碍生活质量评价调查表（OSA-18）观察康复情况，并观察患儿住院期间主要不良事件的发生情况。结果 20名患儿唾液褪黑素基线值（T1）差异无统计学意义，术后早7时（T8）比术前7 h（T4）降低（P<0.05），术后第2日早7时（T11）恢复，3 d（T4、T8、T11）早7时的唾液褪黑素均数超过3 pg/mL。测量3 d相对应的褪黑素时室内光照度和患儿体表温度无差异。FLACC评分、Riker评分和QoR-15评分差异无统计学意义。术后28 d随访OSA-18评分低于术前（P<0.05）。20名患儿均无出现呼吸抑制、窦性心动过缓、窦性心动过速、高血压、低血压和恶心呕吐等不良事件。结论 全身麻醉影响鼾症儿童术后首夜褪黑素的分泌，但不造成抑制，学龄前儿童在上午进行全身麻醉行短小手术不显著干扰褪黑素的分泌而造成昼夜节律紊乱。

• 自发荧光联合频域光学相干断层扫描在急性 Vogt-Koyanagi-Harada综合征诊断及预后随诊中的作用

  田澍蔚, 姚 静, 王建明, 张 洁, 周爱意

  目的 深入探讨眼底自发荧光联合频域光学相干断层扫描在急性Vogt-Koyanagi-Harada综合征（VKH）预后评估和随诊观察中的作用。方法 收集我院2018年5月~2019年11月间12例（23只眼）急性VKH病例，包括详细的病史、最佳矫正视力、裂隙灯、眼底照相、SD-OCT、眼底荧光造影和眼底自发荧光（FAF）等检查，并于治疗一段时间和/或出院后随诊再次行SD-OCT及FAF检查，与入院时进行对比分析。结果 11例患者为双眼发病（91.67%）。眼底检查见视盘水肿16只眼（69.57%）。同时SD-OCT示多处视网膜神经上皮脱离，积液明显（100%）。所有患眼FFA造影早期可见多发性细小点状荧光素渗漏，晚期视网膜下大量荧光渗漏，出现特征性的多囊状的荧光素积存。FAF见高自发荧光区域（100%），范围与FFA荧光积存范围一致。10眼见高自发荧光区域内有片状相对低荧光（43.48%）。4眼高自发荧光区域有“颗粒样”高荧光（17.39%）。VKH恢复期FAF检查见自发荧光分布恢复至正常状态（34.78%）, 或者高自发荧光的强度减低范围缩小（39.13%）（平均面积减小了55.2%，相对荧光强度减低了46.52%）。6只眼病变范围仅剩一些点状高自发荧光颗粒散在分布（26.09%）。SD-OCT视网膜下积液明显减少甚至消失（相对入院时积液量平均减少69.5%）。并且FAF荧光强度与SD-OCT中视网膜下积液呈正相关（r=0.626，P<0.05）。结论 眼底荧光造影、眼底自发荧光成像联合SD-OCT可以提高VKH诊断准确率。FAF、SD-OCT等非侵入性检查可以作为判断恢复及病情监测的检查手段。

• LncRNA MEG3通过抑制HIF1α的表达降低胶质瘤U251细胞的增殖与侵袭能力

  罗奇志, 张 帆, 李 威, 王 芳, 邬力祥, 黄柏胜

  目的 探讨lncRNA MEG3过表达通过调控HIF1α对胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响。方法 采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法检测人胚脑胶质细胞（HFGC）和胶质瘤U251细胞lncRNA MEG3和HIF1α的表达，HIF1α蛋白的表达则采用Western blot法检测；将U251细胞分为3组，6孔/组。Con组：正常培养的U251细胞；NC组：采用脂质体lipofectamine2000将pcDNA3.1空载体转染至U251细胞；pcDNA3.1-MEG3组：采用脂质体lipofectamine2000将pcDNA3.1-MEG3载体转染至U251细胞。另外，对上述3组细胞进行缺氧处理12 h。分别通过qRT-PCR法或Western blot法检测各组细胞HIF1α的表达，采用MTT法检测各组U251细胞增殖情况，Transwell侵袭实验检测各组U251细胞的侵袭。结果 U251细胞中lncRNA MEG3的表达明显低于 HFGC（P<0.05），而 HIF1α mRNA 和蛋白的表达均高于 HFGC（P<0.05）；U251 细胞中，MEG3 过表达组 HIF1α mRNA和蛋白的表达均降低（P<0.05），而且在缺氧12 h后HIF1α蛋白的表达亦降低（P<0.05）。过表达MEG3导致细胞增殖及侵袭力下降（P<0.05）。结论 lncRNA MEG3通过调控HIF1α的表达抑制U251细胞的增殖和侵袭，并可能为胶质瘤的临床治疗提供潜在的分子靶点。

• 胸腹腔镜食管癌根治术对患者术后免疫功能的影响

  杏福宝, 张 雷, 唐 震, 李小军, 贡会源, 王 彪, 胡雁南

  目的 探讨胸腹腔镜食管癌切除术对患者术后免疫功能的影响。方法 选取2017年1月~2019年12月蚌埠医学院第一附属医院行食管癌切除术的患者，根据手术方式不同，将患者分为腔镜微创组（41例）和传统（三切口）开放手术组（40例）。两组患者分别于术前1天和术后第1、4、7天采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测免疫学指标：CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值以了解两种术式后机体免疫状况改变情况；并使用放射免疫分析法测定两组患者术前及术后第1、7天血浆白细胞介素6（IL-6）及皮质醇（Cor）变化水平；采用ELISA法检测患者术前及术后第1、7天的β-内啡肽（β-EP）水平；并测定记录患者术前及术后第1、7天的白细胞计数（WBC）及C-反应蛋白（CRP）水平。收集以上所有实验数据进行分析比较。结果 两组患者术后均未出现死亡。两组患者术后第4天和第7天胸腹腔镜组患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值高于传统手术组，差异具有统计学意义（P<0.05）。而术后第1、7天所测定的 Cor、β-EP、WBC、CRP以及IL-6较术前差异有统计学意义（P<0.05）。同一时间组间相比：传统组除了术后第7天IL-6水平较腔镜组差异未见统计学意义外，其余以上各项指标均高于腔镜组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 胸腹腔镜食管癌切除术能降低术后患者体内促炎因子的分泌，减轻术后炎症反应发生，促进机体术后免疫功能恢复，加速患者的康复。且手术操作安全性高，值得推广。

• 口腔黏膜拭子法可用于无创检测线粒体tRNAThr15927G>A突变

  唐志宁, 唐霄雯, 薛 凌, 管敏鑫

  目的 探索口腔黏膜拭子法在临床上检测母系遗传性线粒体tRNAThr15927G>A（m.15927G>A）突变的可行性。方法 对温州医科大学附属第一医院2070例母系遗传性线粒体疾病病例进行测序筛选，获得3例携带m.15927G>A突变病例（突变组）和3例正常志愿者（对照组）的口腔黏膜样本和血液样本。提取样本全基因组DNA后进行DNA浓度和纯度分析，再对其PCR产物进行斑点印迹杂、Southern blot印迹杂交和DNA测序分析，以验证口腔黏膜拭子法检测m.15927G>A突变的可行性。结果 突变组和对照组口腔黏膜样本和血液样本提取的DNA浓度无显著差异（P>0.05），而手工法提取的口腔黏膜DNA纯度显著低于试剂盒法提取的血液及口腔黏膜DNA纯度（P<0.05）。斑点印迹杂交和Southern Blot印迹杂交提示对照组均呈阳性结果，而突变组均呈阴性结果。DNA测序结果示突变组中均可检测到m.15927G>A突变。结论 口腔黏膜拭子法是一种准确、灵敏的无创检测m.15927G>A突变的方法，具有较高的临床应用价值。