南方医科大学学报杂志

南方医科大学学报杂志2023年第2期

• 体外重建宫颈癌的三维培养模型：基于人宫颈癌组织的去细胞支架

  毛建英, 杨文静, 郭 和, 董瑞丽, 任丽芳, 李树斌

  目的 利用人宫颈癌组织制备去细胞化细胞外基质（ECM）支架组织，并评估该支架组织对3D培养模型中宫颈癌细胞生物学行为的影响。方法 采用十二烷基醚硫酸钠（SLES）溶液作为去细胞溶剂处理人宫颈癌组织，制备去细胞化ECM支架组织。通过病理学染色及生化含量分析等方法分析去细胞ECM支架组织的超微结构和关键成分胶原、糖胺聚糖、弹性蛋白及DNA含量，确定其最佳制备流程。将人宫颈癌SiHa细胞注射至去细胞化ECM支架组织中进行再细胞化，通过HE染色、免疫组织化学染色及分子生物学技术分析评估3D培养模型中及常规二维培养的SiHa细胞的迁移、增殖以及上皮间质转化（EMT），分析该支架组织中对宫颈癌细胞的生物学作用。用5-氟尿嘧啶（5-Fu）处理再细胞化3D培养模型后通过流式细胞术检测细胞凋亡，分析去细胞ECM支架组织对宫颈癌细胞抗药性的作用。结果 采用 SLES 溶液制备的宫颈癌组织去细胞ECM支架组织中，ECM的微环境结构及生物活性被有效地保留。在再细胞化的3D培养模型中，该ECM支架组织具有促进SiHa细胞增殖、迁移、EMT及抗药性的生物学作用。结论 本研究成功制备了基于宫颈癌组织的去细胞ECM支架组织，为构建宫颈癌体外3D研究模型奠定了基础。

• LASS2/TMSG1过表达抑制人肺癌A549细胞增殖和促进A549细胞凋亡：基于上调神经酰胺和p38 MAPK进而启动级联信号传导通路

  刘峥璐, 宣成睿, 韩希然, 郑泽泽, 肖 瑞, 宝鲁日, 徐晓艳

  目的 探究人源性长寿保障基因2/肿瘤转移抑制相关基因1（LASS2/TMSG1）过表达对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响并探讨相关机制。方法 对课题组先前构建好的人肺癌A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组进行如下实验：Western blot检测LASS2/TMSG1蛋白表达水平，平板克隆形成实验、CCK-8法、Hoechst/PI双染、流式细胞术检测A549细胞体外增殖能力及凋亡情况。将14只裸鼠随机分为阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组，7只/组，分别向对应组别的裸鼠颈背部皮下注射A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1过表达组细胞悬液，构建裸鼠移植瘤模型，检测LASS2/TMSG1基因过表达对A549细胞体内增殖能力的影响。Western blot检测A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平。ELISA法分析A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK蛋白含量。 结果 与阴性对照组相比，LASS2/TMSG1基因过表达组A549细胞LASS2/TMSG1蛋白表达量显著升高（P<0.05），体外增殖能力下降（P<0.05），早期凋亡率上升（P<0.05），移植瘤细胞体内增殖受到抑制（P<0.05），A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达量均显著升高（P<0.05），A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK含量显著增加（P<0.05）。结论 LASS2/TMSG1基因过表达能显著抑制人肺癌A549细胞的体内、外增殖能力，促进肿瘤细胞早期凋亡，这可能与LASS2/TMSG1基因过表达后上调了神经酰胺及其下游的效应分子p38 MAPK蛋白进而启动级联信号传导通路有关。

• 人诱导多能干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元祖细胞

  徐佳佳, 李洋洋, 仲光尚, 方祝玲, 刘淳博, 马彩云, 王春景, 郭 俣, 刘长青

  目的 探讨人诱导多能干细胞（hiPSCs）体外高效定向分化为中脑多巴胺能神经元祖细胞（DAPs）的方法体系。方法 人iPSCs诱导分化为DAPs遵循两个主要阶段，第1阶段是化学诱导产生中间态细胞，人iPSCs在含小分子化合物组合的神经诱导培养基中培养至第13天，其表观特征类似于原始神经上皮细胞。第2阶段，特异性诱导DAPs，将中间态细胞在神经分化培养基中诱导至第28天获得DAPs。CM-DiI染色后，定向移植帕金森（PD）大鼠模型右前脑内侧束（MFB），实验动物随机分为3组：健康对照组，模型组和DAPs移植组。移植后2周的大鼠全脑冷冻切片免疫荧光检测移植细胞在宿主脑内微环境中存活、迁移及分化状况，移植后8周，对细胞移植组PD大鼠进行行为学鉴定。结果 人iPSCs可在基质胶上稳定传代，具有正常的二倍体核型，表达多潜能性标记物OCT4、SOX2和Nanog，且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得原始神经上皮细胞形成玫瑰花结样结构，且能够表达其表面特征性标记物（SOX2、Nestin和PAX6，91.3%~92.8%）。诱导至第28天的DAPs高表达其特异性的标记物（TH、FOXA2、LMX1A和NURR1，93.3%~96.7%）。而且，DAPs移植PD大鼠脑内2周后，可分化为TH+，FOXA2+与Tuj1+神经元，移植后8周, 移植组较模型组相比，经水迷宫实验（P<0.0001）和阿扑吗啡（APO）诱导的旋转实验（P<0.0001）检测，PD大鼠的运动功能得到明显改善。结论 人iPSCs经多级诱导可高效分化为中脑DA能神经元祖细胞，具备体内和体外分化为功能神经元与胶质细胞的潜能，并可显著改善PD大鼠的运动功能障碍，为hiPSCs-DAPs移植治疗神经系统损伤疾病奠定细胞基础和实验依据。

• 基于单中心490例胃神经内分泌肿瘤建立的列线图具有良好的预后预测性能

  张奔龙, 鲁意迅, 李 力, 高云鹤, 梁文全, 郗洪庆, 王鑫鑫, 张珂诚, 陈 凛

  目的 开发和验证一种有效的列线图，用以评估胃神经内分泌肿瘤（G-NEN)患者的个体预后。方法 采用回顾性病例对照的研究方法，收集2000年1月~2021年12月在解放军总医院第一医学中心确诊为G-NEN患者的临床病理资料，依据严格的纳排标准筛选，共纳入490例患者为研究对象。采用SPSS 26.0与R 4.2.0软件进行数据整理及分析统计：log-rank检验分析生存率的组间差异，Cox回归模型分析得出影响G-NEN患者预后的独立危险因素并纳入列线图，采用一致性指数（C?index）、受试者工作特征曲线（ROC）及其曲线下面积（AUC）、校准曲线、临床决策曲线（DCA）及其曲线下面积（AUDC）验证该模型的效能，并与第8版美国癌症联合委员会（AJCC）的TNM分期系统进行比较。结果 490例G-NEN患者年龄58.6±10.92岁；男性346例（70.6%），女性144例（29.4%）；病理分级为NET G1的患者130例（26.5%），NET G2患者 54例（11.0%），NEC患者206例（42.0%)，MiNEN患者100例（20.5%），未发现NET G3的患者；Ⅰ~Ⅳ期患者个数分别为：222例（45.3%），75例（15.3%），130例（26.5%），63例（12.9%）。单因素分析结果显示，年龄、性别、吸烟史、饮酒史、病理分级、Ki-67指数、肿瘤形态、肿瘤位置、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、F-NLR是影响患者预后的危险因素（P<0.05），多因素分析结果显示，年龄、病理分级、肿瘤位置、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、F-NLR 是影响 G-NEN 患者生存的独立危险因素（P<0.05）。列线图模型C?index为0.829（95% CI：0.800~0.858），1年、3年、5年总体生存率的ROC曲线下面积分别0.883、0.895、0.944。校准曲线证实模型与实际观测结果具有较好的一致。TNM 分期系统与列线图模型的 1年、3年、5年总体生存率DCA曲线下面积分别为：0.033和0.0218、0.191和0.148、0.248和0.197，表明列线图模型与TNM分期系统都具有明显的正向净收益，但列线图预测模型表现了更高的净收益，显示出更好的临床效用。结论 本研究基于490例G-NEN患者数据建立的列线图预后预测模型具有良好的预测性能和临床应用价值，对于临床医生更加简便快捷的评估G-NEN个体化预后具有显著意义。

• 间断性热暴露导致自发性高血压大鼠的胸主动脉损伤：基于激活AMPK/mTOR/ULK1通路

  杨春丽, 薛姝婧, 武晓敏, 侯 玲, 徐 涛, 李光华

  目的 探讨不同热暴露方式对自发性高血压大鼠胸主动脉血管损伤的影响及其机制。方法 选用自发性高血压大鼠（SHR），构建热暴露大鼠模型，分为对照组SHR-CN（n=9，饲养在24 ℃室温下），间断性热暴露组SHR-8（n=9，每天接受任意连续8 h热暴露，其余时间饲养在与对照组相同的条件下）和持续性热暴露组SHR-24（n=9，持续暴露在32 ℃高温下）。进行自噬和通路干预的SHRs，分别于热暴露前30 min腹腔注射自噬激活剂Rapa，抑制剂3-MA和AMPK抑制剂Compound C（CC）。通过苏木素-伊红染色（HE）观察大鼠胸主动脉形态的变化；利用Western blot和免疫荧光（IF）分别检测高血压大鼠胸主动脉自噬相关因子Beclin1、LC3B和p62的表达情况；利用TUNEL检测高血压大鼠胸主动脉凋亡的情况，Western blot检测Caspase-3，Bax和Bcl-2的表达情况；用自噬的激活剂和抑制剂干预高血压大鼠后，检测自噬和凋亡相关因子的表达情况；免疫组化（IHC）检测通路相关因子的表达情况，大鼠腹腔注射AMPK抑制剂Compound C（CC）后，进一步观察通路及自噬的表达情况。结果 HE染色显示，SHR-8组胸主动脉内膜排列分布不完整，细胞分布紊乱。Western blot显示Beclin1、LC3II/LC3I表达增高，p62降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。TUNEL结果表明SHR-8组中凋亡阳性细胞数明显高于对照组。Western blot表明热暴露后Bax表达升高，Bcl-2表达降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。3-MA抑制自噬的表达，同时凋亡表达降低，Rapamycin促进自噬和凋亡的表达。IHC显示，与SHR-CN相比，SHR-8组p-mTOR明显降低，p-AMPK和p-ULK1表达升高。腹腔注射CC降低了p-AMPK和p-ULK1的表达，同时自噬相关因子LC3B和Beclin1表达降低。结论 不同热暴露下，间断性热暴露导致自发性高血压大鼠胸主动脉形态、自噬和凋亡相关因子表达变化显著，其作用机制可能是通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路来实现的。

• 连翘酯苷B抑制小鼠脑缺血/再灌注引起的氧化应激损伤：基于激活AMPK/DAF-16/FOXO3通路

  陈 兴, 王开万, 储德海, 朱 羽, 张文兵, 曹慧萍, 谢文宇, 鲁传豪, 李 侠

  目的 研究连翘酯苷B（FB）对脑缺血/再灌注（I/R）引起的氧化应激损伤的保护作用及作用机制。方法 将90只C57BL/6小鼠随机分为 5 组，假手术组（Sham），模型组（model），FB 低、中、高剂量组（10、20、40 mg/kg），采用大脑中动脉阻塞（MCAO）2 h，再灌注24 h，制备脑I/R模型。试剂盒检测小鼠脑组织ROS、MDA、PCO、8-OhdG、SOD、GSTα4、CAT、GPx水平，Western blot 检测小鼠脑组织 AMPK、P-AMPK、DAF-16、FOXO3、P-FOXO3 蛋白表达。在此基础上，采用 AMPK 抑制剂Compound C（CC）验证FB是否通过AMPK发挥抑制氧化应激损伤作用，将36只C57BL/6小鼠随机分为，Sham组、model组、FB（40 mg/kg）组、FB（40 mg/kg）+CC（10 mg/kg）组。TTC染色检测脑梗死体积，试剂盒检测ROS、SOD水平，Western blot检测小鼠脑组织AMPK、P-AMPK、DAF-16、FOXO3、P-FOXO3蛋白表达。结果 与model组比较，FB可降低小鼠脑组织ROS、MDA、PCO、8-OHdG水平，升高小鼠脑组织中抗氧化酶SOD、GSTα4、CAT、GPx活性，提高AMPK、FOXO3磷酸化及DAF-16蛋白表达水平（P<0.01）。与FB组比较，FB+CC组AMPK和FOXO3磷酸化水平降低，DAF-1表达减少，脑梗死体积增加，ROS水平升高，SOD水平降低（P<0.01）。结论 FB能够抑制I/R引起的脑组织氧化应激损伤，作用机制是通过促进AMPK磷酸化、其下游DAF-16蛋白表达及FOXO3磷酸化，促进抗氧化酶的表达，清除过量ROS，从而发挥治疗缺血性脑卒中的作用。

• WNT2b高表达的成纤维细胞破坏肠道黏膜屏障

  肖姝喆, 成燕玲, 朱 云, 唐 芮, 古建标, 兰 林, 何志华, 刘丹琼, 耿岚岚, 程 旸, 龚四堂

  目的 探讨WNT2b高表达成纤维细胞破坏肠黏膜，促进炎症性肠病（IBD）进展的机制。方法 通过体外细胞共培养及条件培养，构建成纤维细胞对Caco-2细胞的作用模型。实验组为加入20%成纤维细胞条件培养基或与WNT2b高表达成纤维细胞共培养，对照组为不含条件培养基或与野生型成纤维细胞共培养，通过跨膜电阻和荧光黄渗透率测定，评估Caco-2细胞屏障通透性的变化。与WNT2b高表达或对照肠道成纤维细胞共培养后，使用免疫荧光法检测Caco-2细胞β-catenin入核情况，使用Western blot法检测ZO-1、E-Cadherin等紧密连接蛋白表达情况。采用DSS（葡聚糖硫酸钠）对C57小鼠进行类IBD肠炎造模，实验组使用Salinomycin（5 mg/kg，腹腔注射），对照组为对应溶剂生理盐水，分别对小鼠进行处理，评价该抑制剂对肠炎的治疗作用。结果 与对照组相比，过表达WNT2b基因可致成纤维细胞分泌WNT2b蛋白显著增加，并促进Caco-2细胞β-catenin入核（P<0.01），紧密连接蛋白表达下降；Caco-2细胞中敲低FZD4表达可逆转这一作用。Salinomycin可明显减轻对DSS小鼠肠道炎症并使肠黏膜紧密连接蛋白表达增多。结论 WNT2b高表达成纤维细胞破坏肠黏膜屏障功能，是治疗IBD的潜在靶点。

• 一种操作简便的小鼠原代白色成熟脂肪细胞培养方法

  申屠志博, 弓 欣, 杨慧娣

  目的 建立一种适合短期培养、操作简便、成本低廉的白色成熟脂肪原代细胞培养的方法。方法 本研究通过分离小鼠附睾处和肾周白色成熟脂肪细胞后，分别采用短期成熟脂肪细胞培养方法和天花板培养方法，培养原代白色成熟脂肪细胞。油红O染色鉴定并观察成熟脂肪细胞细胞形态，CCK8法测定细胞活性，并通过Western blot 检测PPARγ蛋白相对表达量，qPCR检测CD36、FAS、CPT1A、FABP4 mRNA表达量。结果 油红O染色显示改良培养方法细胞形态良好、均一，而天花板法细胞形态出现变化。CCK8显示新鲜分离的白色成熟脂肪细胞与此培养方式细胞活性差异无统计学意义（P=0.959，P=0.657，P=0.694）。Western blot显示新鲜分离的白色成熟脂肪细胞与培养72 h细胞的PPARγ蛋白表达量差异无统计学意义（P=0.759），在使用GW9662处理后显著下降（P<0.001）。qPCR显示，经过GW9662处理后CD36、CPT1A mRNA表达量上调（P<0.001，P=0.003），FAS、FABP4 mRNA表达量下调（P=0.001，P<0.001）。结论 本研究建立了一种培养时间短、操作简单的原代白色成熟脂肪细胞的培养方法，为成熟脂肪细胞的相关研究提供技术保障。

• 经淋巴管超声造影可提高甲状腺癌中央区转移淋巴结的检出率

  张 艳, 赵佳航, 王 冰, 林轶群, 孟书玉, 罗渝昆

  目的 探讨通过腺体内注射实现的经淋巴管超声造影（LCEUS）对甲状腺癌颈部中央区转移淋巴结的诊断价值。方法 2020年11月~2022年5月期间，对怀疑为甲状腺癌并拟行超声引导下穿刺活检的患者行颈部中央区淋巴结常规超声及LCEUS检查，所有患者均行外科手术清扫淋巴结，根据淋巴结的造影剂灌注特点将其分为：均匀增强、不均匀增强、规则或不规则环状增强及无增强，以病理结果为金标准，将中央区淋巴结分为转移组与未转移组，比较常规超声及LCEUS对转移淋巴结的诊断能力。结果 最终纳入49例甲状腺癌患者，共60个淋巴结，病理证实34个为转移淋巴结，26个为良性。以不均匀增强，不规则环状增强及无增强为恶性诊断标准，则LCEUS诊断转移淋巴结的灵敏度，特异度，准确度分别为：97.06%，92.31%，95%，均高于常规超声（P<0.001）。ROC曲线分析结果显示LCEUS诊断转移淋巴结的曲线下面积明显高于常规超声（94.7% [0.856~0.988] vs 78.2%[0.656~0.878]，P=0.003)。结论 LCEUS可提高中央区淋巴结的显示及诊断准确率，对临床治疗决策的制定有重要指导意义。

• 抑郁症状与肾功能快速下降及慢性肾脏病的发生无相关性

  杨孟迪, 尹鸿涛, 甄洁玉, 丁雨露, 王玉洁, 孙琳楠, 何风英, 甄东户

  目的 探讨肾功能正常的中老年人群基线抑郁症状与肾功能快速下降以及进展为慢性肾脏病风险的相关性。方法 选取2011年开展的“REACTION”研究兰州地区40~75岁eGFR≥60 mL·min-1·1.73m-2且无蛋白尿的居民并于2014年开始随访，对2次调查资料完整并且符合要求的4961例参与者进行研究。根据PHQ-9问卷得分将基线人群分为2组：无抑郁症状和有抑郁症状组。使用Cox回归比较两种抑郁状态下各组的肾功能快速下降以及慢性肾脏病（CKD）发病情况及其相关性。结果（1）PHQ-9得分与基线血清肌酐（SCr）、尿微量白蛋白（ALB）、尿微量白蛋白/肌酐（UACR）以及肾小球滤过率（eGFR）无关；（2）在平均随访3.4±0.6年后，有33.9%基线时有抑郁症状的参与者出现肾功能快速下降，有3.6%进展为CKD；（3）平均随访3.4±0.6年后发现，肾功能快速下降及进展为CKD的发病风险与有无抑郁症无关（P>0.05），即使对抑郁症进行不同分类，也未观察到明显的相关性（均P>0.05）。结论 抑郁症状的有无与普通人肾功能快速下降及进展为CKD的发生无关。

• 载脂蛋白E通过激活ERK/MMP9信号通路促进子宫内膜癌细胞的迁移

  吴超英, 程文俊

  目的 研究载脂蛋白E（APOE）在子宫内膜癌转移中的具体作用及分子调控机制。方法 子宫内膜癌HEC-1B细胞常规培养，空白对照组siRNA以及APOE靶向的siRNA转染子宫内膜癌HEC-1B细胞，以及采用空载质粒和APOE过表达质粒转染子宫内膜癌HEC-1B细胞，分为空白对照组siCtrl、siAPOE组、空载质粒组、APOE过表达质粒组。利用划痕实验和Transwell实验检测子宫内膜癌细胞的迁移能力，通过MTT实验及流式细胞术验证APOE对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响，使用Hoechst染色法检测干扰APOE后HEC-1B细胞的凋亡情况，采用qPCR、Western blotting观察ERK/MMP9信号通路的变化；通过免疫组化的方法分析APOE的表达与子宫内膜癌组织分化程度的相关性。结果 划痕实验和Transwell小室实验结果显示，与空白对照组相比，转染了siAPOE的HEC-1B细胞的迁移能力均明显下降（P<0.05）。与空载质粒组相比，过表达APOE能显著促进子宫内膜癌细胞HEC-1B的迁移能力（P<0.05）。MTT实验及流式细胞术结果显示APOE对细胞增殖无影响。Hoechst染色实验结果表明干扰APOE后HEC-1B细胞的凋亡能力没有受到影响。Western blotting结果显示敲低APOE能够降低子宫内膜癌细胞中MMP9的蛋白表达水平（P<0.05），而过表达APOE 能使细胞内MMP9的蛋白水平升高（P<0.05）；U0126能够抑制过表达APOE对MMP9的促进作用（P<0.05）。免疫组化结果显示，APOE在子宫内膜癌组织的表达水平比癌旁组织高。结论 APOE在子宫内膜癌组织中呈高表达，APOE可通过影响ERK的磷酸化，促进子宫内膜癌细胞中MMP9的表达，促进子宫内膜癌细胞的迁移。

• Lnc-TMEM132D-AS1高表达明显降低非小细胞肺癌对奥希替尼的敏感性

  赵齐林, 王 楠, 李亚霁, 吴庆琛, 吴兰香

  目的 建立奥希替尼获得性耐药非小细胞肺癌（NSCLC）细胞模型，筛选耐药前后差异表达的长链非编码RNA（lncRNAs），并探讨筛选的lncRNA在奥希替尼获得性耐药中的作用及分子机制。方法 奥希替尼获得性耐药细胞株H1975_OR和HCC827_OR是由奥希替尼敏感的NSCLC细胞株H1975和HCC827（分别命名为H1975 _S和HCC827_ S）建立而来；通过CCK-8、克隆形成及流式凋亡实验检测细胞对奥希替尼的敏感性；RNA测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（qPCR）技术筛选耐药前后差异表达的lncRNAs；采用CCK-8、克隆形成及Transwell实验检测所筛选的lncRNA在NSCLC细胞奥希替尼获得性耐药中的作用；通过核质分离、生物信息学分析及qPCR技术观察该lncRNA的亚细胞定位，并探索其下游互作分子。结果H1975_OR与HCC827_OR对奥希替尼的耐药指数分别为598.70和428.82（P<0.001）。耐药株的生长增殖与克隆形成能力显著提高，而凋亡率降低（P<0.01）。RNA-seq提示H1975_OR与H1975_S之间以及HCC827_OR与HCC827_S之间有共同差异表达的lncRNAs 34个。qPCR验证发现，lnc-TMEM132D-AS1在耐药性NSCLC细胞株中升高最为显著（P<0.01）。TCGA数据库分析提示，lnc-TMEM132D-AS1在NSCLC组织中的表达水平高于癌旁组织（P<0.001），且与患者预后不良相关（P<0.05）。Lnc-TMEM132D-AS1过表达可提高奥希替尼处理下敏感株的生长增殖、克隆形成及迁移能力（P<0.05），而敲低其表达水平可部分恢复耐药株的奥希替尼敏感性（P<0.01）。lnc-TMEM132D-AS1主要定位在胞质，生物信息学分析提示hsa-miR-766-5p是其潜在靶点，两者表达水平呈负相关（P<0.01）。对hsa-miR-766-5p下游的靶mRNAs分析提示相关基因主要集中于Ras信号通路。结论 Lnc-TMEM132D-AS1在奥希替尼获得性耐药NSCLC细胞株中表达显著上调，明显降低了NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性，是NSCLC奥希替尼获得性耐药的潜在生物标志物及治疗靶标。

• 棉酚短期给药对小鼠的生殖毒性和肾毒性具有可逆性

  王 辉, 朴智燕, 马 慧, 曹琳育, 刘 俊, 武军驻

  目的 研究棉酚短期给药对小鼠睾丸和肾脏的影响，同时探究该影响是否具有可逆性。方法 将20只7~8周雄性小鼠随机分成4组：空白对照组、溶剂对照组、棉酚给药组和停药组，分别给与纯化水、1%羧甲基纤维素钠水溶液、30 mg/mL棉酚溶液和30 mg/mL棉酚溶液，每只小鼠每天灌胃1次，0.3 mL/次，连续灌胃14 d后。将空白对照组、溶剂对照组、棉酚给药组小鼠处死，取组织样本；停药组小鼠停止给药，纯化水灌胃14 d后处死，取组织样本。睾丸组织进行称重、HE染色和PAS染色；肾脏组织进行HE染色和线粒体ATPase活力检测。结果 与对照组相比，棉酚给药组小鼠睾丸生精上皮层细胞的数量明显减少，生精小管变圆，生精小管之间空隙明显变大，睾丸间质萎缩，精原细胞分化不完全，无长形精子细胞，大量细胞处于圆形精子细胞状态，顶体PAS反应阴性。肾脏弥漫性系膜细胞增生，系膜基质增多，与肾小囊壁层粘连，肾小囊腔明显缩小甚至消失；肾脏线粒体ATPase活力降低（P<0.001）。停药组与棉酚给药组相比，睾丸和肾脏形态结构、顶体PAS反应及线粒体ATPase活力均有不同程度的恢复。结论 棉酚短期给药处理后出现生殖毒性和肾毒性，停药后一段时间症状得到恢复，具有可逆性。

• 左氧氟沙星联合纤维素酶在体外能有效根除卡介苗生物被膜感染

  张志飞, 廖洪建, 杨 敏, 胡 璨, 杜永洪

  目的 探究左氧氟沙星（LEV）和纤维素酶（CL）对结核杆菌模式菌—卡介苗（BCG）生物被膜的体外抗菌效果。方法 采用XTT法与结晶紫染色法确定BCG生物被膜的成熟生长周期。不同浓度的LEV和CL单独或联用处理BCG浮游菌及BCG生物被膜，采用结晶紫染色定量生物被膜中生物量的变化。然后将成熟的BCG生物被膜用CL单独处理24 h，通过SYTO 9染色、Calcofluor White Stain染色后，在共聚焦激光扫描显微镜观察活菌数量、生物被膜中纤维素含量变化，扫描电子显微镜下观察生物被膜的结构变化。结果 采用微量肉汤稀释法检测LEV的MIC、MBC和MBEC值分别为4、8和1024 μg/mL。浓度为2.56、5.12和10.24 U/mL的CL与1/4×MIC抗生素（LEV）的组合会导致生物被膜生物量减少（P<0.001）。CL在10.24、5.12和2.56 U/mL3种浓度下对成熟BCG生物被膜均表现出明显的分散效应（P<0.001）。结论 当左氧氟沙星与纤维素酶联合使用时，抗生素能有效根除BCG生物被膜感染。

• 补肾活血方通过下调JAK2/STAT3通路改善小鼠的复发性流产

  赵佳琳, 陈 萍, 徐广立, 孙建华, 阮媛媛, 薛苗苗, 吴悦靓

  目的 基于胎盘组织酪氨酸激酶（JAK2）与转录激活子（STAT3）信号通路，探讨补肾活血法治疗复发性流产（RSA）的疗效。方法 CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠合笼建立正常对照组；CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠合笼建立RSA小鼠模型，按照随机数字表法分为模型组、地屈孕酮组和补肾活血法组，6 只/组，于妊娠第1天起，补肾活血法组予补肾活血方（BSHXF）灌胃，地屈孕酮组予以地屈孕酮溶液，正常对照组及模型组予以等体积蒸馏水，干预12 d。ELISA测定各组小鼠血清抗凝血酶原Ⅲ（AT-Ⅲ）、活化蛋白C（APC）、组织型纤溶酶原激活因子（t-PA）、孕酮（P）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）、雌二醇（E2）含量；HE染色法观察小鼠子宫内膜形态变化；Western blot法测定小鼠胎盘p-JAK2、p-Stat3、BCL-2表达。结果 与正常组相比，模型组胚胎丢失率明显升高，血清AT-Ⅲ、t-PA、P、APC水平降低，p-JAK2、p-STAT3、Bax蛋白相对表达量升高，Bcl-2蛋白相对表达量降低（P<0.05）；与正常组比较，模型组AT-Ⅲ、t-PA、P、APC、HCG水平均降低（P<0.05）。与模型组比较，BSHXF组与地屈孕酮组血清AT-Ⅲ、t-PA、HCG水平均升高；BSHXF组APC水平降低，地屈孕酮组血清P水平升高（P<0.05）。结论 补肾活血法可通过下调JAK2/STAT3通路改善血栓前状态，抑制细胞凋亡，有效提高妊娠率。

• 基于人工智能技术的鼻咽癌风险预测模型的构建与评价

  张浩轩, 陆 进, 蒋成义, 方美芳

  目的 利用人工智能（AI）技术筛选鼻咽癌（NPC）患者死亡的危险因素，并构建风险预测模型。方法 基于SEER数据库（1973~2015）NPC患者的临床数据；采用SPSS 25.0软件对数据进行处理，并按7∶3随机分为建模组和验证组；利用R软件对建模组数据采用极限梯度提升（XGBoost）、决策树(DT）、套索算法（LASSO）与随机森林（RF）等4种AI算法筛选NPC患者死亡的危险因素，并构建风险预测模型。用C-指数（C-index）、决策曲线分析（DCA）、受试者工作特征曲线（ROC）和校准曲线（CC）等4种方式对模型进行内部评价；利用验证组数据和搜集的临床数据对模型进行内部验证与外部验证。结果 共纳入2116例NPC患者的临床数据（建模组1484例；验证组632例）；建模组数据筛选影响NPC患者死亡的危险因素有年龄、种族、性别、Stage_M、Stage_T和Stage_N，利用其构建NPC风险预测模型的内部评价的C-index为0.76、ROC曲线下面积AUC=0.74、DCA净获益率为9%~93%，内部验证的C-index为0.740、ROC曲线下面积AUC=0.749、DCA净获益率为3%~89%，且CC高度一致；外部验证数据的C-index为0.943；DCA净获益率为（3%~97%）；ROC曲线下面积AUC=0.851；而CC显示预测值与真实值之间具有良好的一致性。结论 性别、年龄、种族以及TNM分期是NPC患者死亡的危险因素，而NPC风险预测模型具有准确性、一致性、区分性与实用性等价值。

• GATA3+Treg细胞在变应性鼻炎中的表达及意义

  孙 柳, 焦沃尔, 孔勇刚, 杨长亮, 续 珊, 谯月龙, 陈始明

  目的 研究GATA3+Treg细胞在变应性鼻炎（AR）患者和小鼠中的表达和意义。方法 收集6例对照组患者（Control组）和6例变应性鼻炎患者（AR组）的鼻黏膜，检测其鼻黏膜炎症反应。同期收集12例Control组和12例AR组患者外周血单个核细胞（PBMC），检测其Treg细胞和GATA3+Treg细胞比例。将C57BL/6小鼠分为正常对照组（Control组）和变应性鼻炎组（AR组）。比较两组小鼠AR症状学评分、外周血OVA-sIgE水平、鼻黏膜炎症反应。收集小鼠脾脏，检测两组小鼠体内Treg细胞和GATA3+Treg细胞比例以及Th2细胞因子表达。结果 与Control组相比，AR组患者鼻黏膜中嗜酸性粒细胞浸润和杯状细胞增生明显增多（P<0.01），PBMC中Treg细胞和GATA3+Treg细胞表达下降（P<0.05）。动物实验发现：与Control组相比，AR组小鼠过敏症状评分、外周血OVA-sIgE水平、鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润和杯状细胞增生均明显增加（P<0.01）。与Control组相比，AR 小鼠 Treg 细胞和 GATA3+Treg 细胞表达下调（P<0.01），并且Th2细胞因子 IL-4、IL-6、IL-10 表达上升（P<0.05）。结论 GATA3+Treg细胞在AR患者和小鼠中表达下降，并可能与Th2细胞免疫应答相关，两者共同参与了AR的发生发展。GATA3+Treg细胞有望成为AR免疫调控的新靶点。

• 牙龈卟啉单胞菌在体外可破坏脐静脉内皮屏障功能：基于下调ZO-1、occludin和VE-cadherin的表达

  曾 娇, 李心竹, 殷琳莹, 陈 婷, 侯 晋

  目的 通过体外实验探讨牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）破坏内皮屏障功能的分子机制。方法 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）体外培养形成屏障后，使用感染复数（MOI）100的P. gingivals感染细胞，对照组为未感染P. gingivals的HUVECs；通过跨膜电阻值（TEER），异硫氰酸荧光素（FITC）-右旋糖酐通透性实验和细菌易位实验来评估内皮屏障功能；并使用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot实验检测P. gingivals对构成内皮屏障结构的主要蛋白紧密连接蛋白1（ZO-1），occludin和VE-cadherin表达的影响。结果 HUVECs在接种培养后第5天，其跨膜电阻值趋于稳定，体外内皮屏障形成。与对照组相比，感染P. gingivals后0.5 h，内皮屏障功能即会发生改变，并且随着感染时间的延长，屏障功能障碍更加显著，主要表现为：跨膜电阻值下降、40 000 /70 000 FITC-Dextran通透性上升以及易位细菌的数量增加；MTT结果显示P. gingivals对HUVECs的增殖能力没有影响（P>0.05）；除此之外，与对照组相比，HUVECs感染P. gingivals后24和48 h后，qRT-PCR和Western blot结果显示被感染的 HUVECs 中 ZO-1，occludin 和 VE-cadherin 的 mRNA 和蛋白水平出现明显的下调表达（P<0.05）。结论 P.gingivalis可以通过下调细胞间连接蛋白ZO-1、occludin和VE-cadherin的表达破坏内皮屏障，导致内皮屏障功能障碍。

• 鹦鹉热衣原体III型分泌蛋白SINC通过激活MAPK/ERK信号通路促进宿主细胞自噬

  曾心靛, 陈 利, 周 鹏, 唐 婷, 陈 曦, 胡 丹, 王 川, 陈丽丽

  目的 探讨鹦鹉热衣原体（Cps）SINC蛋白对宿主细胞自噬的影响，及MAPK/ERK信号通路在其中的调控作用。方法 用重组的SINC蛋白刺激小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7），Western blot检测LC3-II和Beclin-1的水平及ERK1/2的磷酸化程度，并用间接免疫荧光法检测SINC蛋白刺激后细胞LC3的水平，透射电镜检测自噬特殊结构。用50 μmol MEK1/2抑制剂U0126预处理RAW 264.7细胞后1 h，再用不同浓度SINC蛋白刺激不同时间，用间接免疫荧光检测LC3的水平，并用Western blot检测LC3-II和Beclin-1的表达水平。结果 Western blot检测结果显示，以2 μg/mL SINC蛋白刺激RAW 264.7细胞12 h时，LC3-II和Beclin-1的表达水平显著上调，并达到峰值；间接免疫荧光检测发现SINC刺激后可使细胞内LC3荧光斑点数明显增多，透射电镜下可见更多的自噬小体和自噬溶酶体。2 μg/mL SINC蛋白刺激RAW 264.7细胞15 min时p-ERK1/2/ERK1/2比值明显上调；加入抑制剂U0126后，LC3-II和Beclin-1表达下调，LC3-II荧光斑点聚集减少。结论 SINC蛋白通过激活MAPK/ERK信号通路促进RAW 264.7细胞发生自噬。

• 慢性肾脏病对肌钙蛋白诊断急性心肌梗死准确性的影响

  邓钰莹, 陈华锋, 李功辉, 陈立桁, 傅 强

  目的 评价肌钙蛋白（cTn）在慢性肾脏病（CKD）患者中诊断急性心肌梗死（AMI）的表现，并探索提高诊断准确性的方法。方法 回顾性纳入 2018年1月~2020年12月南方医科大学珠江医院高危胸痛患者；根据肾功能水平分为CKD+组126例、CKD-组272例，根据最终诊断结果分为AMI+组122例、AMI-组276例。通过病历系统收集各组患者临床基线情况及相关血液化验结果，所有化验均要求在入院12 h内完成。结果 在未发生AMI的患者中，CKD+组cTnT较CKD-组升高（P<0.001），且cTnT与eGFR存在中等强度的负相关关系（rs=-0.501，P<0.001）；但cTnI在两组中无统计学差异（P=0.72）。在CKD患者中，cTnT诊断AMI的最佳界值为0.177 μg/L，cTnI为0.415 ng/mL；cTnI诊断特异度较cTnT更高。cTnT与cTnI联合诊断模型为P=eY（/1+eY），Y=6.928（cTnT）-0.5（cTnI）-1.491，其AUC值高于单个cTn。结论 CKD患者的cTn诊断界值较普通患者升高；cTnI的诊断特异度较cTnT更高；联合应用cTnT与cTnI可能有助于进一步提高诊断效能。

• 可诱导共刺激分子参与自发性高血压大鼠肠系膜血管内皮-间质转化及硬化

  都昌乐, 王 瑜 , 付计锋, 曹冬黎, 梅仁彪, 张 奇

  目的 探究可诱导共刺激分子（ICOS）与自发性高血压大鼠（SHR）肠系膜血管内皮-间质转化（EndMT）及硬化的相关性。方法 4周龄SHR大鼠（观察组）及同品系WKY大鼠（对照组）各20只，各组再随机分为4组，5只/组。无创血压测量仪动态监测各组大鼠血压情况，并于4、6、10、30周龄进行实验。采用流式细胞术检测大鼠脾脏CD4+T细胞的ICOS表达频数；RT-PCR法检测大鼠肠系膜中ICOS、VE-cad、α-SMA、Col3 mRNA表达；免疫组化技术检测大鼠肠系膜血管VE-cad、α-SMA、Col3及淋巴组织中ICOS、IL-17A、TGF-β的分布情况；ELISA法检测大鼠血浆中IL-17A、TGF-β含量水平；Masson染色观察大鼠肠系膜血管形态变化；Spearman和Pearson相关分析评价ICOS与VE-cad、α-SMA、Col3及胶原容积分数的相关性。结果 SHR大鼠自6周龄开始，与对照组相比收缩压增高（P<0.05）；CD4+T细胞ICOS的表达频数高于同期对照组（P<0.05）；肠系膜组织中ICOS、α-SMA、Col3、IL-17A和TGF-β的 mRNA及蛋白表达相较于对照组均升高（P<0.05），VE-cad mRNA及蛋白则在10周龄时表达下降（P<0.05）；自6周龄始SHR大鼠血浆中IL-17A、TGF-β含量水平提升（P<0.05）；肠系膜血管硬化程度不断加剧（P<0.05）；肠系膜组织中ICOS mRNA及蛋白表达水平与α-SMA、Col3表达水平和血管硬化程度自6周龄始均呈正相关（P<0.05），与VE-cad表达水平自10周龄始呈负相关（P<0.05）。结论 ICOS可能通过介导相关免疫反应在高血压肠系膜血管EndMT及硬化过程中发挥重要作用。

• 血清脂蛋白相关磷脂酶A2水平与伴高血压的急性缺血性脑梗死复发正相关

  梁丽冰, 陈静娟, 章成国, 王玉凯, 罗柏桂, 周天恩, 王晓锋

  目的 探究在伴高血压的急性缺血性脑卒中（AIS）患者中，血清脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）浓度及复发风险之间的相关性。方法 采用回顾性病例对照研究，纳入211例确诊伴高血压的急性脑梗死患者，入院24 h内检测血清Lp-PLA2浓度,对纳入研究的患者进行1年随访观察，根据头颅CT/MR证实脑梗死复发而分为复发组（35例）和非复发组（176例），根据高血压分级分为3组，分别为1 级高血压组（60例，复发5例）、2 级高血压组（76例，复发11例）、3 级高血压组（75例，复发19例）。单因素分析两组间的临床资料及Lp-PLA2浓度，采用多因素logistic回归分析、趋势性分析、平滑曲线拟合分析血清Lp-PLA2浓度与伴高血压的急性脑梗死复发风险的相关性，采用ROC曲线对不同高血压分级伴AIS中Lp-PLA2浓度与复发风险进行预测效能评价。结果 与非复发组对比，复发组中血清Lp-PLA2浓度、年龄、入院时NHISS评分、7 d时mRS评分、HCY、吸烟间的差异有统计学意义（P<0.05）。多因素回归分析中，当调整混杂因素后，与Lp-PLA2最低三分位组相比，Lp-PLA2最高三分位组的复发风险增加了4.13倍（OR=5.13，95% CI：1.35~19.40），而当Lp-PLA2作为连续变量时，Lp-PLA2每增加1 ng/mL，伴高血压的缺血性脑卒中患者复发风险增加1%( OR=1.01 95% CI：1.01~1.02）。平滑曲线显示Lp-PLA2浓度与高血压合并脑梗死的复发风险呈正相关。Lp-PLA2浓度预测3级高血压伴AIS患者复发风险的ROC曲线下面积为0.869，特异度为0.893，敏感度为0.737。结论 血清Lp-PLA2浓度是伴高血压的急性脑梗死患者复发风险的独立危险因素，且可能是3级高血压伴AIS复发风险的有效预测指标。

• 大豆异黄酮可减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤：基于抑制铁死亡及炎症级联反应

  李 晒, 李 丽, 闵思敏, 刘赛赛, 秦志文, 熊志尚, 徐建国, 王博文, 丁渡山, 赵士弟

  目的 基于大豆异黄酮（SI）对区域脑血流（rCBF）、铁死亡、炎症反应和血脑屏障（BBB）通透性的级联调控作用，探讨SI抗脑缺血/再灌注损伤机制。方法 将120只雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、缺血/再灌注组（I/R组）和大豆异黄酮预处理组（SI组），40只/组。采用改良线栓法合并激光多普勒血流仪（LDF）建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型。术中各组大鼠通过LDF实时监测脑皮层血流动态变化；术后通过光镜和透射电镜观察脑组织病理形态、神经元和BBB超微结构变化，评估神经缺损程度，量化脑梗死、脑水肿和BBB破坏程度，分光光度法检测缺血半暗带Fe2+、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）含量，ELISA法测定血清TNF-α和IL-1β活性，Western blot法和IHC法检测病灶周围GPX4、MMP-9和Occludin表达。结果 插线成功后I/R组和SI组大鼠rCBF均呈现骤降趋势，而拔线后I/R组rCBF上升慢于SI组；rCBF存在插线后不稳定和拔线后未复流状况。I/R组神经细胞固缩严重，线粒体变小、膜密度增加、嵴减少，紧密连接松散、基底膜厚薄不均，SI组各结构损伤相较于I/R组呈不同程度减轻。与Sham组相比，I/R组神经缺损评分、脑梗死体积、脑含水量和伊文思蓝渗透量明显增加（P<0.01），Fe2+和MDA含量增多、GSH含量及GPX4表达降低（P<0.01），MPO含量和血清TNF-α、IL-1β活性增高（P<0.01），MMP-9表达增多、Occludin表达减少（P<0.01）；与I/R组相比，SI组神经缺损评分、脑梗死体积、脑含水量和伊文思蓝渗透量降低（P<0.05或P<0.01），Fe2+和MDA含量减少、GSH含量及GPX4表达升高（P<0.05或P<0.01），MPO含量和血清TNF-α、IL-1β活性降低（P<0.05或P<0.01），MMP-9表达下调、Occludin表达上调（P<0.05，P<0.01）。结论 SI预处理可能通过改善脑血流，抑制铁死亡、炎症反应和保护BBB，进而减轻脑缺血/再灌注损伤。