南方医科大学学报

作者：周燕霞,胡韦维,张虹洋,邹琳,张鹏辉

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T细胞，为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点靶向设计4对向导RNA（sgRNA），构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒，将其转染至HEK293T细胞内，通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养，利用T7核酸内切酶1（T7E1）酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率，有限稀释法筛选单克隆细胞，测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458 质粒，T7E1 酶切检测四对sgRNA 的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD 基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的细胞株构建成功，细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低，细胞增殖能力下降，维生素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T稳定细胞模型，为后期研究基因的修复奠定了基础。

来源：2019年第03期

《南方医科大学学报》期刊编辑部

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