南方医科大学学报

作者：周丽婷, 叶 颖, 原海波, 吴超逸, 吴淑燕

关键词：CRISPR/Cas9；巨噬细胞；gasdermin D,

目的 利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW 264.7，为研究gasdermin D（GSDMD）在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法 针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA（sgRNA），构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定，将Cas9质粒和pGL3-sgRNA串联载体分两步电转至巨噬细胞RAW 264.7；qPCR检测cas9的表达；嘌呤霉素筛选出阳性单克隆后PCR、Western blot和测序鉴定。将鼠伤寒沙门菌与gsdmd-/-RAW 264.7细胞共培养，Annexin Ⅴ/PI染色及比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放水平分析细胞死亡情况。结果 qPCR结果表明获得稳定表达cas9的RAW 264.7-Cas9细胞（P<0.01）；PCR 及测序证明 pGL3-sgRNA 串联载体构建成功；PCR、测序及 Western blot 结果表明成功构建 gsdmd-/- RAW 264.7 细胞。Annexin Ⅴ/PI染色及LDH释放水平发现敲除gsdmd可降低巨噬细胞死亡率（P<0.01）。结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞，为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡及其机制奠定基础。

来源：2021年第1期

《南方医科大学学报》期刊编辑部

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