南方医科大学学报

作者：张 涛, 李维丽, 邱晓拂, 刘百川, 李高远, 冯才鑫, 廖俊发, 林康健

关键词：TEAD1；勃起功能障碍；糖尿病；平滑肌细胞；表型转化；CRISPR/Cas9,

目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMCs）中TEAD1基因，探讨TEAD1基因对糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型转化的影响。方法 利用链脲佐菌素建立糖尿病性ED大鼠模型。原代及传代培养CCSMCs，并进行免疫荧光染色鉴定。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA（sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3），构建表达载体并转染293T细胞，包装并收集慢病毒，将其感染糖尿病性ED大鼠CCSMCs，嘌呤霉素筛选阳性细胞，Western blot检 测TEAD1蛋白的表达水平。然后将实验分3组：敲除TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs为实验组（CCSMCs-sgRNA-2）、空载体病毒感染组为阴性对照组（CCSMCs-sgRNA-NC）、不感染病毒组为空白对照组（CCSMCs-CK），分别使用qRT-PCR和Western blot检测各组细胞表型标志物平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）、碱性调宁蛋白（Calponin）和增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA和蛋白水平的表达。结果 原代培养的糖尿病性ED大鼠CCSMCs α-SMA阳性细胞率达95%以上。成功包装了含有TEAD1-sgRNA的重组慢病毒，筛选得到了稳定低表达TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs细胞系。Western blot结果显示感染TEAD1-sgRNA-2的糖尿病性ED大鼠CCSMCs中TEAD1蛋白水平最低（P<0.05）。qRT-PCR和Western blot结果显示，敲除 TEAD1 基因的糖尿病性 ED 大鼠 CCSMCs，SMMHC 和 Calponin mRNA 和蛋白水平的表达均显著上调（P<0.05），而PCNA mRNA和蛋白水平的表达均显著减少（P<0.05）。结论 利用CRISPR/Cas9基因技术成功构建了定向敲除TEAD1基因的慢病毒载体，TEAD1基因的缺失可使糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型从合成型向收缩型转化。

来源：2021年第4期

《南方医科大学学报》期刊编辑部

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