南方医科大学学报

作者：李 阳, 赵 倩, 宋晓伟, 宋金超

单位：上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200082；上海理工大学附属市东医院麻醉科，上海 200082；海军军医大学第一附属医院心血管内科，上海 200082

关键词：工程化剪接因子；腺病毒；YAP1；可变剪接,

目的 构建人工剪接因子，实现调控心肌细胞YAP1的可变剪接。方法 本研究根据Pumilio1的序列特异性，针对YAP1的Exon6构建不同序列的剪接因子。实验分为3组：野生型PUF-SR作为阴性对照组、人工化的PUF-SR腺病毒转染组、质粒转染组。实验流程：使用同源重组的方法构建腺病毒，将人工化的PUF-SR的PCR片段克隆到pAd-Track质粒中，再将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中进行质粒扩增。扩增后的质粒经PacⅠ酶切后，转染到293A细胞，进行腺病毒包装。将得到的腺病毒载体转染到培育的乳鼠心肌细胞中。选用Ad-Track质粒用于对照转染组，通过载体转染法将其转染到乳鼠心肌细胞中。定量和半定量PCR法检测YAP1的可变剪接，Western blot法检测融合蛋白Flag的信号，并使用GAPDH抗体检测GAPDH作为加载对照。结果 腺病毒转染组对心肌细胞的转染效率接近100%，质粒转染组中并没有发现荧光蛋白。在Western blot实验中，阴性对照和靶向YAPExon6XULIE 序列的Flag-SR-NLS-PUF都能够检测到融合Flag的蛋白的表达。在反转录PCR和PCR检测YAP1的可变剪接实验中，结果都显示YAP1的第4个target序列所构建的人工剪接因子能够有效调控YAP1 Exon 6的剪入（P<0.05）。结论 本实验成功构建出能够调控YAP1可变剪接的腺病毒，并且在SD大鼠的心肌细胞中得到了验证。

来源：2022年第7期

《南方医科大学学报》期刊编辑部

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